ICS
11.020
CCS C05
团
体 标 准
T/LNSI 009-2024
人自然杀伤细胞
Human natural killer cells
2024-08-15 发布
2024-08-15 实施
辽宁省免疫学会 发 布
T/LNSI 009-2024
目
次
前
言....................................................................................................................................................................II
1 范围.....................................................................................................................................................................1
2 规范性引用文件.................................................................................................................................................1
3 术语和定义.........................................................................................................................................................1
4 符号和缩略语.....................................................................................................................................................2
5 技术要求.............................................................................................................................................................2
6 检验方法.............................................................................................................................................................3
7 检验规则.............................................................................................................................................................4
8 使用说明.............................................................................................................................................................5
9 标签.....................................................................................................................................................................5
10 包装、储存及运输...........................................................................................................................................6
11 废弃物处理.......................................................................................................................................................6
附 录 A（规范性）细胞标志性蛋白和纯度检测
流式细胞测定法............................................................. 7
1
T/LNSI 009-2024
前
言
本文件按照 GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化的文件结构和起草规则》的规定
起草。
本文件由沈阳艾米奥生物工程技术研发中心有限公司、沈阳市再生生物医学重点实验室提出。
本文件由辽宁省免疫学会归口。
本文件起草单位：沈阳艾米奥生物工程技术研发中心有限公司、沈阳市再生生物医学重点实验室、
中国医科大学干细胞与再生医学研究室、沈阳干细胞与再生医学重点实验室、辽宁艾米奥干细胞与再
生医学研究院有限公司、辽宁省细胞生物学学会、辽宁省生物技术协会、沈阳市干细胞与再生医学产
业技术创新联盟、沈阳药科大学、中国医科大学附属第一医院、中国医科大学附属口腔医院、中国医
科大学附属盛京医院、艾米奥国际干细胞医院有限公司。
本文件主要起草人：庞希宁、庞然、施萍、赫甡、高航、姜雯宇、宋扬、郭然、单风平、王竟、
孟涛、刘纯燕、李晓航、王莉莎、徐东芬、荆晶、谢光麟、邵锡柱、张美玲、聂宏光、郎宏鑫、刘晓
玉、王喜良、张涛、赵峰、张殿宝、王瑞、李彩虹、李宏图、潘长伟、孔娟、王哲、王蔚、殷军、张
宁、李津阳、王静、王娇。
II
T/LNSI 009-2024
人自然杀伤细胞
1
范围
本文件规定了人自然杀伤细胞的技术要求、检验方法、检验规则、使用说明、标签、包装、储存、
运输和废弃物处理要求。
本文件适用于人体组织分离的活干细胞分化或转分化获得的人自然杀伤细胞的质量控制。
本文件适用于抗体诱导的纯因子培养法培养的人自然杀伤细胞。
2
规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文
件，仅该日期对应的版本适用于本文件。不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适
用于本文件。
WS 213 丙型肝炎诊断
WS 273 梅毒诊断
WS 293-2019 《艾滋病和艾滋病病毒感染诊断》
T/CSCB 0001-2022 《人干细胞研究伦理审查技术规范》
T/CSCB 0002-2022 《人自然杀伤细胞》
中华人民共和国药典（2020 年版）
全国临床检验操作规程
3
术语和定义
3.1
人自然杀伤细胞
human natural killer cells
人体组织分离的或干细胞分化或转分化获得的，具有非特异性杀伤、抗体依赖性细胞毒性、免疫
调节功能的固有淋巴细胞。
1
T/LNSI 009-2024
4
符号和缩略语
下列符号和缩略语适用于本文件。
ADCC
——抗体依赖细胞毒性（Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity）
NK
——自然杀伤细胞（Natural Killer Cells）
CD
——自然杀伤细胞膜表面分化抗原簇（Cluster of Differentiation）
STR
——短串联重复序列（Short Tandem Repeat）
Calein-AM ——钙黄绿素乙酰氧基甲酯（Calcein Acetoxymethyl Esterr）
5 技术要求
5.1 细胞形态
体外培养呈悬浮状，活化后体积变大或形状变为不规则，周围可见一个或多个伪足样突起。
5.2
染色体核型
正常核型应为 46,XX 或 46,XY。
5.3
细胞标志蛋白
CD3 阴性 CD56 阳性率≥70%。
5.4
细胞纯度
具有 CD56 标志蛋白阳性表达细胞含量≥80%。
5.5
细胞存活率
新鲜制备未冻存细胞≥90%；冻存细胞复苏后应用前≥70%
5.6
微生物
真菌、细菌、支原体、衣原体、HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、HCMV、TP 等均应为阴性。
5.7
内毒素
内毒素应≤0.5EU/mL。
5.8
细胞 STR 鉴定
2
T/LNSI 009-2024
人体组织分离的或干细胞分化或转分化获得的人自然杀伤细胞，应进行 STR 检测及分型鉴定，无
样品间的交叉污染。
6
检验方法
6.1
细胞形态
使用倒置显微镜×400 倍观察细胞，体外二维悬浮培养条件中，静息状态下呈圆形或不规则形悬
浮生长，激活后形态变大变长。
6.2
染色体核型
按照《中华人民共和国药典(2020 年版)》中“生物制品生产检定用动物细胞基质制备及检定规程”
项检验。
注：根据目的样本特性确定应有的核型结果。正常核型应为 46,XX 或 46,XY。
6.3
细胞标志性蛋白
按照附录 A 的方法检验。
6.4
细胞纯度
按照附录 A 的方法检验。
6.5
细胞存活率
按照 T/CSCB0002—2020 检验。
6.6
微生物
真菌、细菌、支原体和衣原体按照《中华人民共和国药典(2020 年版)》检验。人类免疫缺陷病毒
按照 WS 293-2019 检验。乙型肝炎病毒、人类嗜 T 细胞病毒、人类疱疹病毒、人巨细胞病毒按照《全
国临床检验操作规程》检验。丙型肝炎病毒按照 WS 213 检验。梅毒螺旋体按照 WS 273 检验。
6.7
内毒素
内毒素按照《中华人民共和国药典(2020 年版)》检验。
6.8
细胞 STR 鉴定
3
T/LNSI 009-2024
按照 T/CSCB 0002—2020 检验。
7 检验规则
7.1 批
在一个生产周期在中，同一生产线、同一来源、同一代次、同一方法制备出来的产品为一批。
7.2
抽样
在同一批的产品中随机抽取 3 个最小包装单位。
7.3
出厂检验
7.3.1
每批产品应进行出厂检验，并附检验报告。
7.3.2
出厂检验项目应包括第 5 章规定的所有项目。
7.4
复核检验
若客户需要，应由第三方专业细胞检验机构或实验室进行复核检验，检验项目应包括第 5 章规定
的所有项目。
7.5
判定规则
7.5.1
出厂检验项目全部符合第 5 章规定，判为合格品；有 1 项及以上不符合本标准规定，则判为不
合格品。
7.5.2
复核检验项目全部符合第 5 章规定，判为合格品；有 1 项及以上不符合本标准规定，则判为不
合格品。
8
产品使用说明书
至少包括以下内容：
a）
产品名称；
b）
细胞代次；
c）
细胞数量；
d）
生产日期；
4
T/LNSI 009-2024
e）
生产批号；
f）
生产组织；
g）
储存条件；
h）
运输条件；
i）
使用方法；
j）
执行标准号；
k）
生产地址；
l）
联系方式；
m）
邮政编码；
n）
注意事项。
注：根据用户需求，可标注内毒素含量。
9
产品标签
至少包括以下内容：
a） 产品名称；
b） 细胞代次；
c） 细胞数量；
d） 生产批号；
e） 生产组织；
f） 生产日期。
10 包装、储存及运输
10.1 包装
应选择对人自然杀伤细胞关键质量属性无影响的袋或瓶中，应选用 100 毫升 0.9%生理盐水袋或瓶。
10.2
储存
10.2.1
应符合T/CSCB 0001—2020 要求。
10.2.2
应在低于-130℃环境下储存。
10.3
运输
5
T/LNSI 009-2024
10.3.1 应符合 T/CSCB 0001—2020 要求。
10.3.2 冻存的细胞应在干冰或低于-130℃条件下运输，非冻存细胞建议在 2℃~8℃下运输。
11 废弃物处理
11.1 建立废弃细胞管理文档
人自然杀伤细胞生产和检查过程中产生的废弃物应建立废弃细胞管理文档，严格执行管理规范并
详细记录。
11.2
不合格的细胞、剩余废弃的细胞或捐赠物处理办法
人自然杀伤细胞研究和生产中不合格的细胞、剩余废弃的细胞或捐赠物，应进行合法、妥善并符
合伦理的处理。
6
T/LNSI 009-2024
附 录 A
（规范性）
A.1
仪器和设备
A.1.1 流式细胞仪。
A.1.2 离心机。
A.2 试剂
A.2.1 PBS 溶液。
A.2.2 2%胎牛血清液（2%FBS）。
A.2.3 CD3、CD56 抗体。
A.2.4 按照相应要求配制流式检验所需的液体：洗涤液、抗体稀释液。
A.3 样品保存
洗涤液和染色后的样品于 2℃~8℃保存。相关抗体按说明书保存。
A.4 检测步骤
A.4.1 样品准备和抗体孵育
收集单细胞，250g 离心 3min。弃上清，加入适量稀释后的抗体进行孵育（按照抗体说明书进行
稀释使用）。
A.4.2
流式细胞术分析
用洗涤液重悬细胞，然后通过 40μm 滤网转移到流式管中，按流式细胞仪应用手册上机检测。
A.4.3
圈门设定原则
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T/LNSI 009-2024
首先根据前向角散射光信号（FSC）和侧向角散射光信号（SSC）设门圈出目标细胞分群 1，排除
死细胞和其他杂细胞，然后根据同型对照组荧光强度，在分群 1 的基础上标记出阳性细胞群 2，排除
没有被荧光抗体标记的阴性细胞。抗体同型对照作为阴性对照。
A.5
结果分析
得到的检测结果用软件综合分析，具体参考其软件使用说明。
8
9