ICS 11.020
CCS C05
团
体 标 准
T/LNSI 008-2024
人脐带间充质干细胞
Human umbilical cord mesenchymal stem cells
2024-08-15 发布
2024-08-15 实施
辽宁省免疫学会 发 布
T/LNSI 008-2024
目
次
前
言 ............................................................................... III
1
范围 ................................................................................ 1
2
规范性引用文件 ...................................................................... 1
3
术语和定义 .......................................................................... 1
4
符号和缩略语 ........................................................................ 2
6
检验方法 ............................................................................ 5
7
检验规则 ............................................................................ 6
9
标签 ................................................................................ 8
10
包装、储存及运输 ................................................................... 8
11
废弃物处理 ......................................................................... 9
附录 A（规范性）细胞存活率检测 细胞计数法 ..............................................10
附录 B（规范性）细胞标志蛋白检测 流式细胞法 ............................................12
附录 C（规范性）成骨分化检测 茜素红 S 染色法 ............................................14
附录 D（规范性）成脂分化检测 油红 O 染色法 ..............................................16
附录 E（规范性）成软骨分化检测 阿尔新蓝染色法 ..........................................18
附录 F（规范性）成瘤性检测 免疫缺陷小鼠检测法 ..........................................20
附录 G（规范性）干细胞对淋巴细胞增殖抑制检测 干细胞共培养法 ............................22
I
T/LNSI 008-2024
II
T/LNSI 008-2024
前
言
本文件按照 GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化的文件结构和起草规则》的规定起
草。
本文件由沈阳艾米奥生物工程技术研发中心有限公司、沈阳市再生生物医学重点实验室提出。
本文件由辽宁省免疫学会归口。
本文件起草单位：沈阳艾米奥生物工程技术研发中心有限公司、中国医科大学干细胞与再生医学研
究室、沈阳干细胞与再生医学重点实验室、辽宁艾米奥干细胞与再生医学研究院、辽宁省细胞生物学学
会、辽宁省生物技术协会、沈阳市干细胞与再生医学产业技术创新联盟、沈阳药科大学、中国医科大学
附属第一医院、中国医科大学附属口腔医院、中国医科大学附属盛京医院、艾米奥国际干细胞医院。
本文件主要起草人：庞希宁、庞然、施萍、单风平、王莉莎、赫甡、宋扬、徐东芬、荆晶、姜雯宇、
高航、谢光麟、邵锡柱、王竟、孟涛、张美玲、聂宏光、郎宏鑫、刘晓玉、王喜良、张涛、赵峰、张殿
宝、王瑞、李彩虹、李宏图、潘长伟、孔娟、王哲、王蔚、殷军、郭然、张宁、李晓航。
III
T/LNSI 008-2024
人脐带间充质干细胞
1
范围
本文件规定了人脐带间充质干细胞的技术要求、检验方法、检验规则、使用说明、标签、包装、储
存、运输和废弃物处理要求。
本文件适用于人脐带间充质干细胞的生产和检测。
2
规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，
仅该日期对应的版本适用于本文件。不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本
文件。
WS 213 丙型肝炎诊断
WS 273 梅毒诊断
WS 293-2019 《艾滋病和艾滋病病毒感染诊断》
T/CSCB 0001-2022 《人干细胞研究伦理审查技术规范》
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则
中华人民共和国药典（2020 年版）
全国临床检验操作规程
3
术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
间充质干细胞 mesenchymal stem cells
1
T/LNSI 008-2024
主要来源于中胚层的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞，广泛存在于全是多种组
织中，可在体外培养扩增，并在特定条件下分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。
3.2
人脐带间充质干细胞 human umbilical cord mesenchymal stem cells
来源于人脐带华氏胶组织，贴壁培养后呈纺锤形和梭形的成纤维细胞态，可在体外自我更新并具有
成骨、成脂、成软骨等分化能力的间充质干细胞。
4
符号和缩略语
下列符号和缩略语适用于本文件。
CD
——分化簇（Cluster of Differentiation）
DNA
——脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic Acid）
EBV
——疱疹病毒（Epstein-Bar Virus）
HBV
——乙型病毒性肝炎（Hepatitis B Virus ）
HCMV
——人巨细胞病毒（Human Cytomegalovirus）
HCV
——丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus）
HIV
——人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus）
HLA-DR ——人类白细胞抗原-DR（Human Leukocyte Antigen-DR）
5 HTLV ——人类嗜 T 细胞病毒（Human T-lymphotropic Virus）
IDO ——吲哚胺 2,3-双加氧酶（Indoleamine 2,3-dioxygenase）
IFN-γ ——干扰素-γ（Interferon-γ）
TNF-α ——肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α）
PCR ——聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）
STR ——短串联重复序列（Short Tandem Repeat）
TP ——梅毒螺旋体（Treponema Pallidum）
技术要求
2
T/LNSI 008-2024
5.1
原材料和辅料
5.1.1
应符合 T/CSCB 0001-2022 要求。
5.1.2
应建立供者细胞采集的供者评估与筛选标准、采集方法、运输标准和交接标准，保证供者和细
胞的安全。
5.1.3 供体应筛查 HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、HCMV 和 TP，并记录结果。
5.2 分离与培养方法
5.2.1 分离及提取
采用组织块贴壁法从脐带华氏胶组织中分离培养脐带间充质干细胞。进行人脐带间充质干细胞原代
培养。
5.2.2
人脐带间充质干细胞换液
根据细胞的生长情况换液。
5.2.3
人脐带间充质干细胞传代
传代操作应密度适宜、及时、迅速。
5.2.4
人脐带间充质干细胞冻存
冻存细胞程序降温后置液氮中保存。
5.2.5
人脐带间充质干细胞复苏
取出冻存管进行快速融化，离心洗涤后进行培养。
5.2.6
人脐带间充质干细胞溶液
人脐带间充质干细胞溶液为均质状态，无絮状沉淀，细胞存活率≥90％。
5.3 关键质量属性
5.3.1 细胞形态
细胞贴壁培养时呈纺锤形和梭形的成纤维细胞态，形态均一。
3
T/LNSI 008-2024
5.3.2
染色体核型
正常核型应为 46,XX 或 46,XY 且 400-550 条段阶段未见染色体异常。
5.3.3
细胞存活率
未冻存细胞存活率≥90%且冻存复苏后细胞存活率≥70%。
5.3.4
细胞标志蛋白
CD105、CD73、CD90 阳性率均≥95%；CD11b、CD19、CD31、CD34、CD45、HLA-DR 阳性率
≤2%。
5.3.5
三系分化
具有成骨、成脂、成软骨的分化潜能。
5.3.6
成瘤性
免疫缺陷动物（如小鼠）体内成瘤试验结果为阴性。
5.3.7
微生物
真菌、细菌、支原体、HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、HCMV、TP 为阴性。
5.3.8
干细胞对淋巴细胞增殖抑制
应满足下列要求：
——共培养组与阳性对照组相比，白介素 6、肿瘤坏死因子α表达下调，白介素 10 表达上调；
——共培养组与阳性对照组相比，淋巴细胞增殖被显著抑制；
——共培养组与阳性对照组相比，淋巴细胞亚群辅助性 T 细胞上调，细胞毒性 T 淋巴细胞下调。
5.4 过程控制
5.4.1 扩增、冻存、复苏等过程控制应符合 T/CSCB 0001-2022 要求。
5.4.2 细胞 STR 检测结果应与供体细胞保持一致。
4
T/LNSI 008-2024
6 检验方法
6.1 细胞形态
二维培养条件下，用明视场细胞显微镜×40 倍进行观察。
6.2
染色体核型
按照《中华人民共和国药典（2020 年版）》中“生物制品生产检定用动物细胞基质制备及检定规
程”项检验。
6.3
细胞存活率
按照附录 A 的方法检验。
6.4
细胞表面标志物
按照附录 B 的方法检验。
6.5
三系分化
6.5.1
成骨分化
按照附录 C 的方法检验。
6.5.2
成脂分化
按照附录 D 的方法检验。
6.5.3
成软骨分化
按照附录 E 的方法检验。
6.6
成瘤性
按照附录 F 的方法检验。
6.7 微生物
6.7.1 真菌
按照《中华人民共和国药典（2020 年版）》中“1101 无菌检查法”项检测。
5
T/LNSI 008-2024
6.7.2
细菌
按照《中华人民共和国药典（2020 年版）》中“1101 无菌检查法”项检测。
6.7.3
支原体
按照《中华人民共和国药典（2020 年版）》中“3301 无菌检查法”项检测。
6.7.4
HBV
按照《全国临床检验操作规程》核酸法检验。
6.7.5
HCV
按照 WS 213 核酸法检验。
6.7.6 HIV
按照 WS 293-2019 核酸法检验。
6.7.7
HTLV
按照《全国临床检验操作规程》核酸法检验。
6.7.8
EBV
按照《全国临床检验操作规程》核酸法检验。
6.7.9
HCMV
按照《全国临床检验操作规程》核酸法检验。
6.7.10
TP
按照 WS 273 核酸法检验。
6.8
干细胞对淋巴细胞增殖抑制检测
按照附录 G 的方法检测。
7
检验规则
7.1
抽样方法和数量
6
T/LNSI 008-2024
7.1.1
在一个生产周期中，同一生产线、同一来源、同一代次、同一方法制备出来的产品为一批。
7.1.2
在同一批的产品中随机抽取 3 个最小包装单元。
7.2
出厂检验
7.2.1
每批产品应进行出厂检验，并附检验报告。
7.2.2
出厂检验项目应包括 5.3 规定的所有项目。
7.3
复核检验
若客户需要，应由第三方专业细胞检验机构或实验室进行复核检验，检验项目应包括第 5 章规定的
所有项目。
7.4
判定规则
7.4.1
出厂检验项目全部符合 5.3 规定，判定为合格品；有 1 项及以上不符合本文件规定，则判为不
合格品。
7.4.2
复核检验项目全部符合 5.3 规定，判定为合格品；有 1 项及以上不符合本文件规定，则判为不
合格品。
8
使用说明
应至少包括以下内容：
a）
产品名称；
b）
细胞代次；
c）
细胞数量；
d）
生产日期；
e）
生产批号；
f）
生产组织；
g）
储存条件；
h）
运输条件；
i）
使用方法；
7
T/LNSI 008-2024
j）
执行标准号；
k）
生产地址；
l）
联系方式；
m）
邮政编码；
n）
注意事项。
注：根据用户需求，可标注内毒素含量。
9
标签
应至少包括以下内容：
a） 产品名称；
b） 细胞代次；
c） 细胞数量；
d） 生产批号；
e） 生产组织；
f） 生产日期。
10 包装、储存及运输
10.1 包装
应选择对人脐带间充质干细胞关键质量属性无影响的袋或瓶中，应选用 100 毫升 0.9%生理盐水袋
或瓶。
10.2
储存
10.2.1
应符合 T/CSCB 0001-2022 要求。
10.2.2
应在低于-130℃环境下储存。
10.3
运输
10.3.1
应符合 T/CSCB 0001-2022 要求。
10.3.2
冻存的细胞应在干冰或低于-130℃条件下运输，非冻存细胞建议在 2℃~8℃下运输。
8
T/LNSI 008-2024
11
废弃物处理
人脐带间充干细胞生产和检测过程中生产的废弃物应按照 T/CSCB 0001-2022 中的规定处理。
9
T/LNSI 008-2024
附 录 A
（规范性）
A.1 仪器和设备 细胞存活率检测 细胞计数法
A.1.1 明视场显微镜。
A.1.2 血球计数板。
A.2 试剂
除特殊说明外，所用试剂均为分析纯，检测用水均为 18.2MΩ去离子水。
A.2.1 磷酸盐缓冲液：pH 为 7.4。
A.2.2 台盼蓝染液：使用时，用磷酸盐缓冲液（A.2.1）稀释至 0.4%（质量浓度）。
A.3 检测步骤
A.3.1 细胞悬液制备
收集待检测细胞，用磷酸盐缓冲液（A.2.1）配制细胞悬液，稀释至合适的浓度。每个血球计数板
（A.1.2）的 1mm2 的方格中的细胞的数量应为 20 个~50 个细胞。如果高于 200 个细胞，则需要进行稀
释。
A.3.2
细胞染色
按 1:1 的体积比将台盼蓝染液（A.2.2）与细胞悬液（A.3.1）混合均匀。
A.3.3
细胞计数
将盖玻片盖在血球计数板（A.1.2）计数槽上，取 10 μL 混合液（A.3.2）滴在一侧计数室的盖玻片
边缘，另取 10μL 混合液，滴在另一侧计数室的盖玻片边缘，使混合液充满盖玻片和计数板之间，静止
30s，将计数板置明视场显微镜（A.1.1）下对被染色的细胞和细胞总数分别进行计数。对 16×25 规格
的计数室，按对角线位，取左上、右上、左下、右下 4 个 1mm2 的中格（即 100 个小格）计数。对 25
×16 规格的计数室，按对角线位，取左上、右上、左下、右下和中央 5 个中格（即 80 个小格）计数。
当遇到位于大格线上的细胞，一般只计数大方格的上方和左线上的细胞（或只计数下方和右方线上的细
10
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胞）。
按步骤 A.3.2~A.3.3 在重复测定一个样品。
A.3.4 细胞存活率计算
A.4 计算与分析
细胞存活率按式（A.1）进行计算：
X
= (M - S)/X × 100% .........................................（A.1）
式中：
X—细胞存活率；
M—细胞总数；
S—染色的细胞数。
计算两次计数细胞存活率结果的平均值，记为细胞平均存活率。
A.5
精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算数平均值的 10%。
11
T/LNSI 008-2024
附 录 B
（规范性）
B.1 仪器和设备 细胞标志蛋白检测 流式细胞法
B.1.1 流式细胞仪。
B.1.2 水平离心机。
B.1.3 电子天平。
B.2 试剂
本方法所用试剂均为分析纯，除特别说明外，实验用水均为 GB/T 6682 规定的一级水。
B.2.1 磷酸盐缓冲液：pH 7.4。
B.2.2 牛血清白蛋白（BSA）：纯度≥98%。
B.2.3 叠氮钠（NaN3）。
B.2.4 抗人 CD105、CD73、CD90、CD11b、CD19、CD31、CD45、HLA-DR 抗体及同型对照抗体。
B.2.5 按照相应要求使用电子天平（B.1.3）配置流式检测所需的液体：洗涤液、抗体稀释液。
B.3 样品保存
洗涤液和标记后的样品于 2℃~8℃保存。相关抗体遵照说明书保存。
B.4 检测步骤
B.4.1 样品准备
收集细胞，使用水平离心机（B.1.2）300g 离心 4min，弃上清。然后，用洗涤液清洗一遍，使用水
平离心机（B.1.2）300g 离心 4min，弃上清。
B.4.2
抗体孵育
按照抗体说明书进行稀释使用。抗体孵育结束后用洗涤液清洗两遍，使用水平离心机（B.1.2）300g
离心 4min，弃上清。
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B.4.3
过滤上机
用洗涤液重悬细胞，然后通过 40μm 滤网转移到流式管中，按流式细胞仪（B.1.1）应用手册上机检
测。
B.4.4
圈门设定原则
首先根据细胞大小和颗粒度设门圈出目标细胞分群 1，排除死细胞和其他杂细胞，然后根据 Isotype
对照组荧光强度，在分群 1 的基础上画出阳性细胞群 2，排除没有被荧光抗体标记的阴性细胞。抗体
Isotype 作为阴性对照。
B.5
结果分析
得到的检测结果用软件综合分析，具体参考其软件使用说明。
13
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附 录 C
（规范性）
C.1 仪器和设备 成骨分化检测 茜素红 S 染色法
C.1.1 血球计数板。
C.1.2 明视场显微镜。
C.1.3 水平离心机。
C.2 试剂
本方法所用试剂均为分析纯，除特别说明外，实验用水均为 GB/T 6682 规定的一级水。
C.2.1 磷酸盐缓冲液：pH 为 7.4。
C.2.2 消化酶。
C.2.3 台盼蓝染液：使用时，用磷酸盐缓冲液（C.2.1）稀释至 0.4%（质量浓度）。
C.2.4 成骨诱导液。
C.2.5 茜素红 S 染色试剂盒。
C.3 检测步骤
C.3.1 细胞样品的准备
C.3.1.1 细胞消化
使用水平离心机（C.1.3）离心收集细胞于离心管中，用无菌磷酸盐缓冲液轻轻重悬细胞，避免形
成气泡或者残留细胞团块。
C.3.1.2
细胞计数
根据附录 A 方法测定，使用血球计数板（C.1.1）及明视场显微镜（C.1.2）计算细胞悬液活细胞浓
度。
C.3.2
细胞接种并诱导
细胞接种方式、密度及诱导步骤均遵循成骨诱导液产品说明书，诱导 14d~21d。
14
T/LNSI 008-2024
C.3.3
钙结节染色
钙结节染色根据茜素红 S 染色试剂盒说明书进行。
C.4
结果分析
显微镜下可见散在大量橘红色的钙结节。
15
T/LNSI 008-2024
附 录 D
（规范性）
D.1 仪器和设备 成脂分化检测 油红 O 染色法
D.1.1 血球计数板。
D.1.2 明视场显微镜。
D.1.3 水平离心机。
D.2 试剂
本方法所用试剂均为分析纯，除特别说明外，实验用水均为 GB/T 6682 规定的一级水。
D.2.1 磷酸盐缓冲液：pH 为 7.4。
D.2.2 消化酶。
D.2.3 台盼蓝染液：使用时，用磷酸盐缓冲液（D.2.1）稀释至 0.4%（质量浓度）。
D.2.4 成脂诱导液。
D.2.5 油红 O 染色试剂盒。
D.3 检测步骤
D.3.1 细胞样品的准备
D.3.1.1 细胞消化
使用水平离心机（D.1.3）离心收集细胞于离心管中，用无菌磷酸盐缓冲液轻轻重悬细胞，避免形
成气泡或者残留细胞团块。
D.3.1.2
细胞计数
根据附录 A 方法测定，使用血球计数板（D.1.1）及明视场显微镜（D.1.2）计算细胞悬液活细胞浓
度。
D.3.2
细胞接种并诱导
细胞接种方式、密度及诱导步骤均遵循成脂诱导液产品说明书，诱导 14d~21d。
16
T/LNSI 008-2024
D.3.3
脂滴染色
脂滴染色根据油红 O 染色试剂盒说明书进行。
D.4
结果分析
显微镜下可见橙红色的脂滴，脂肪细胞中含大小不等的脂滴。
17
T/LNSI 008-2024
附 录 E
（规范性）
E.1 仪器和设备 成软骨分化检测 阿尔新蓝染色法
E.1.1 血球计数板。
E.1.2 明视场显微镜。
E.1.3 水平离心机。
E.2 试剂
本方法所用试剂均为分析纯，除特别说明外，实验用水均为 GB/T 6682 规定的一级水。
E.2.1 磷酸盐缓冲液：pH 为 7.4。
E.2.2 消化酶。
E.2.3 台盼蓝染液：使用时，用磷酸盐缓冲液（E.2.1）稀释至 0.4%（质量浓度）。