ICS 13.300;11.100 A 80
GB
中华人民共和国国家标准
GB/T 35522—2017
化学品 土壤弹尾目昆虫生殖试验
Chemicals-Collembolan reproduction test in soil
2018-07-01实施
2017-12-29发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会 发布
园
E GB/T 35522—2017
前言
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准与经济合作与发展组织（OECD)化学品测试方法No.232《土壤弹尾目昆虫生殖试验》(Col-
lembolanReproductionTestinSoil)（2009）技术性内容一致。
本标准由全国危险化学品管理标准化技术委员会（SAC/TC251)提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局、环境保护部固体废物与化学品管理技术
中心、上海市化工职业病防治院、中国检验检疫科学研究院、湖北出人境检验检疫局。
本标准主要起草人：缪文彬、陈相、陈俊水、胡训军、王海婷、刘纯新、姚丽芳、蒋伟、陶海华、陈会明、 张静、郭坚。
- GB/T 35522—2017
引言
本标准主要用于评估化学品对于土壤弹尾目跳虫繁殖能力的影响。该标准在已有的试验操作程序
基础上制定。无性生殖的Folsomiacandida和两性繁殖的Folsomiafimetaria是弹尾目跳虫的常见品种，可通过养殖或经市场渠道获得。当这两种跳虫不能满足评估试验对某些特殊栖息地的要求时，也可使用其他任何满足试验有效性的弹尾目种类，
从生态学的角度看，土居跳虫是进行生态毒理学试验较为合适的品种。弹尾目跳虫是一种六足节
肢动物，长有一层纤薄的、极易被水和空气透过的外骨骼，与虾蚂和线蚓相比，具有不同的暴露途径和级别。
在大多数陆生生态系统中，生存于土壤和落叶层中的弹尾目跳虫种群密度一般为每平方米105个。
典型成熟个体为0.5mm～5mm，对土壤生物量和土壤呼吸作用贡献很低，仅为1%～5%。因此，土壤弹尾目跳虫更为重要的作用是作为土壤食微生物和小型动物的食物来源而扮演食物链中潜在的调节者。土壤弹尾目跳虫本身可被包括壁虱、、蜘蛛、步行虫和隐翅虫在内的广泛分布而种类繁多的内生和后生无脊椎动物捕食。土壤弹尾目跳虫有助于酸性土壤的分解。而由于虾蚓和千足虫通常不存在于酸性土壤中，弹尾目跳虫因而成为此类环境中除线蚓以外最重要的无脊椎动物。
F.fimetaria跳虫在世界各地都有分布，从沙土到壤土，从含细腐殖质到含粗腐殖质等几种典型土壤中均广泛存在，是一种无眼无色的弹尾目跳虫，在全欧洲各地的农业土壤中均有发现。有杂食习性，其食物包括真菌菌丝、细菌、原生动物和碎屑物等。F.fimetaria通过接触与感染植物的致病真菌发生相互作用，并影响真菌菌根，这一点与F.candida的作用相同。与多数弹尾目跳虫物种一样，F.fime taria跳虫为有性生殖，要求一直有雄性受精卵的存在。
F.candida同样在世界各地都有分布。尽管在一般土壤中并不常见，此类跳虫在富含腐殖质的土壤中大量存在。它是无眼无色素，叉骨（弹器）发达，时刻处于活跃的游移状态，一旦受到惊扰，就会迅速的移动和跳动。F.candida对生态的影响机制类似于F.fimetaria，但其栖息地主要是有机质含量更高的土壤。F.candida为无性生殖。雄性出现的概率小于千分之一。
Ⅱ GB/T35522—2017
化学品 土壤弹尾目昆虫生殖试验
1范围
本标准规定了化学品土壤中弹尾目昆虫（跳虫）的生殖试验的术语和定义、试验原理、试验方法和步骤、数据与报告。
本标准适用于评估溶于水或不溶于水的物质对土壤中弹尾目昆虫（跳虫）的生殖效应的影响。 本标准不适用于挥发性物质，即亨利常数或气/水分配系数大于1、或在25℃时蒸气压超过0.0133Pa
的物质。
规范性引用文件
2
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
ISO10390土壤质量pH值的测定（Soilquality—DeterminationofpH) ISO11268-2土壤质量污染物对蚯蚓（Eiseniafetida/Eiseniaandrei）的影响第2部分：繁殖效
应的测定（Soilquality—EffectsofpollutantsonearthwormsPart2:Determinationofeffectsonre- productionofEiseniafetida/Eiseniaandrei)
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
无可观察效应浓度 no observed effect concentration;NOEC 在给定的暴露期间，与空白对照比较，受试物质对目标生物没有产生明显不良效应时所对应的最高
浓度（p<0.05）。 3.2
最低可观察效应浓度 lowestobservedeffectconcentration;LOEC 在给定的暴露期间，与空白对照比较，受试物质对目标生物产生明显不良效应时所对应的最低浓度
(<0.05)。 3.3
x%效应浓度 effectconcentrationforx%effect EC 经与空白对照比较，引起受试生物的效应终点参数与对照组相比下降工%时的受试物浓度（力<
0.05)。 3.4
x%致死浓度 lethalconcentrationforx% LC 导致%的试验对象死亡的浓度。
1 GB/T 35522—2017
4试验原理
4.1 将成虫Folsomiafimetaria（F.fimetaria）或幼虫Folsomiacandida（F.candida）同步暴露在含有不同浓度的受试物质的人工土壤中，也可选择其他种类土壤。受试物质与改性人工土壤混合，土壤中有机质含量为5%。试验分为以下两个步骤：
预试验：如无法获取足够的毒理学信息，则应先进行预试验，主要测试2周后F.fimetaria和 3周后F.candida的死亡率和繁殖率。 正式繁殖试验：测试亲代成虫所繁殖幼虫的总数量和亲代成虫的存活率。F.fimetaria跳虫的试验周期为3周，F.candida跳虫的试验周期为4周
4.2受试物质对于成虫死亡率和繁殖率的毒性效应分别采用LC（致死浓度）和EC.（效应浓度）来表示，运用合适的非线性回归分析法以评价分别引起工%跳虫死亡或导致跳虫繁殖降低工%的受试物质浓度；亦可选用NOEC/LOEC(无可观察效应浓度/最低可观察效应浓度）值。
5受试物
5.1理想情况下，应事先掌握受试物质的理化特性水溶性辛醇/水分配系数、土壤/水分配系数以及蒸气压等数据。 另外还需知道受试物质在主壤中环境行为数据，如光解速率水解速率和生物降解速率等。对受试物进行化学鉴定包括化学文摘序列号、批次，批号结构式和纯度应记录存档 5.2本标准适用于溶于水或不溶手水的物质 主要根据受试物质的类型不同施用。 本标准不适用于挥发性物质，即亨利常数或气尿分配系数大或在 25mC时蒸气压超过0.0133 Pa 的物质。
6试验有效性
空白对照样本需满足下列条件时可视为试验结果有效
试验结束时，成熟全体的平均死亡率不高于20% 试验结束时，每个容器中的平均幼体数量至少达到100个；正式试验结束时，计算所得的幼体数量的变异系数低于30%。
7参照物
对于选定的试验土壤样本，应采用参比物在其半数效应浓度下开展对照测试：测试可每隔固定时间段进行，或包含在每次的试验过程中，以证实试验体系中的试验生物响应程度在正常水平以内。硼酸是一种合适的参比物，在每于克（于重）土壤中添加约100mg硼酸，可造成上述两个土壤跳虫物种的繁殖率下降50%。
8试验
8.1仪器设备
宜选用可容纳30g潮湿土壤的器血作为试验容器。容器材质应选用玻璃或情性塑料（无毒）。但
如因吸附作用而导致受试物质的量减少，则应避免使用塑料材质容器。试验容器均应具备一定横截面积，以确保容器中的土壤实际深度达到2cm～4cm。容器要有专门设计的盖子（比如玻璃或聚乙烯材质），以减少水分蒸发，同时又可确保土壤和大气的气体交换。容器至少应有部分为透明，以便于光线照 2 GB/T35522—2017
入。要求配备常规的实验室设备，以下所列为必备设备：
干燥箱（105℃±5℃）；体视显微镜；
——pH计（精确至0.01)和光照度计（精确至11x)； —天平（精确至0.0001g)；一用于温度控制的设备：一用于空气湿度控制的设备（如容器有加盖设计可忽略）；
可控制温度的孵化箱或小室；
-
镊子或低流量的空气流动装置。
8.2制备试验土壤" 8.2.1选用改进的人工土壤，其有机质含量为5%。如人工土壤组分与天然土壤差异较大时，可选用天然土壤。推荐的人工土壤成分（干重状态，105℃温度下烘干至恒重）如下：
-5%水藓泥炭，经风干并磨细至粒径大小为2mm士1mm；一20%高岭土，其中高岭石含量宜大于30%；约74%组分含量的风干工业沙（具体用量取决于所需碳酸钙的含量），成分以细沙为主，其中
超过50%沙的粒径应满足50μm200μm。沙的实际用量取决于碳酸钙含量，沙和碳酸钙合计含量应达到75%；粉末状分析纯碳酸钙，含量低于1%，调节pH值至6.0士0.5；碳酸钙的加人量主要取决于泥炭的质量/性质。
8.2.2将干土在搅拌器中充分混匀。根据附录A所描述的流程确定人工土壤的最大持水量（Water HoldingCapacity，WHC)。应优化试验土壤的含水量以获得疏松多孔的土壤结构，以便于弹尾目跳虫自由进出这些孔隙。最大持水量通常为40%～60%。 8.2.3在试验前2d～7d，在干燥的人工土壤中添加足量的去离子水对土壤进行预湿润，使最终的水持量达到饱和含水量的一半左右，以平衡/稳定土壤酸度。按1：5(参见附录B)的比例将土壤与1mol/L 氯化钾或0.01mol/L氯化钙混合。测试土壤pH值时，如果土壤的酸度值超出了要求的范围，可以通过添加适量的碳酸钙来予以调节。如土壤偏碱性，则可以添加一份对弹尾目跳虫无害的无机酸来进行调节pH值。 8.2.4将经过预湿润的土壤分装至不同的受试物质浓度组（包括参比物组）和空白对照组中。加入受试化合物，调节含水量。 8.3试验动物的选择和准备
推荐将F.candida作为试验物种。这是因为与F.fimetaria相比，F.candida在存活率方面更高，能更好地满足试验的有效性标准。如需使用F.fimetaria，则该物种应满足试验的有效性标准要求，试验开始时，应保证试验动物饲喂情况良好，应选择年龄为23d～26d的F.fimetaria或9d～12d的 F.candida。对于每一个浓度的平行，应确保有10o对雌雄的F.fimetaria，或10只雌的F.candida（见附录C并参见附录D）。从培养血中随机选取同步发育的跳虫，对加入各平行中的各批次跳虫的健康及
1）所需碳酸钙含量取决于土壤基质层的成分，试验开始前需立即测试已经预培养的潮湿土壤分样本的pH值，以
确定碳酸钙的实际用量。建议测试pH值或碳氮比、阳离子交换量和土壤有机物含量，以确保试验后期阶段的标准化、更好诠释试验结果。如确因必要，比如出于特定的试验需求，也可采用从未受污染的区域采集的天然土壤作为试验或培养基。如采用天然土壤，需记录土壤的来源（采集区域）、pH值、质地（颗粒分布情况）、阳离子交换量和有机物含量等特性，并确保土壤不受任何污染。如需使用天然土壤，建议在将天然土壤样本用于正式试验之前，证明其适用于试验并可满足试验的有效性条件。
3 GB/T35522—2017
身体状况进行检查。在随机挑选的试验容器中每组加人10/20只跳虫，选用体型较大的F.fimetaria 雌虫以便于与个体较小的雄虫区分。
8.4受试物质试验浓度的准备
8.4.1选用何种方法取决于化合物的特性以及试验目的。一般情况下，建议将受试物质混人土壤，但试验也可能要求采用与受试物质实际用途一致的施用方法（比如在液态下进行喷洒，或是采用颗粒状或种子敷料等特殊剂型的杀虫制剂）。除非受试物质添加到土壤表面，否则应在添加试验化合物前对土壤进行处理，再让跳虫进人到土壤内部。可采用四种不同的受试物质施用方法：
将受试物质溶于水后混人土壤中作为载体将受试物质溶于有机溶剂后混人土壤中作为载体。 将受试物质与沙拌匀后混人士塘中作为载体将受试物质直接施加到土壤表面。
8.4.2对于水溶性受试物质，用足量去离子水溶解受试物质，溶液分量应足够一个试验浓度下的所有重复试验批次使用。在移入试验容器之前，每份溶液均应与一份预先湿润的土壤充分混合。 8.4.3对于非水溶性受试物质，如受试物质为不溶于水但可溶于有机溶剂的化学物质，应将其溶解在最小体积的适用溶剂（如内酮）中但同时仍应确保该化学物质能与土壤充分混匀，并按要求混入一定量的石英砂 只能使用挥发性的有机溶剂，当使用有机溶剂时所有试验浓度和额外设置的溶剂阴性对照组应加人最小量的溶剂， 且每次用量均相同 试验容器应开定的时间：以方便溶剂的挥发，确保
间里受试物质没有随之减少。
在这段时 8.4.4 如受试物质极难溶全水和有机溶剂 应将部分石英砂混入一 疑量的受试物质后加 入土壤中，从
而获得预期的受试物质浓度，将混合好的石英砂和受武物的混合物加人到经过添加适量去离子水后充分混匀达到含水量要求的湿王中 将最终的混合物分装人试验容器，每个受试物质浓度组均需重复上述步骤，并制备合适的对照组 8.4.5对于施用到土壤表面的受试物质（如杀虫凝）需要以喷洒方式施用于土壤表面。 先将跳虫放人后，再对土壤进行处理。 首先将试验容器装满湿润的主壤基质，然后加人试验动物，并对试验容器称重。 为避免试验动物直接接触受试物质，受试物至少在跳虫引人土壤半小时后才能施加受试物质。为了模拟田间喷洒施用效果，应该尽可能使用合适的实验室喷洒设备，尽可能均匀地将受试物质施用于土壤表面。如受试物质为水溶液、乳浊液或分散剂，施放速度应根据风险评估的数据确定，施用受试物质时环境温度的差异范围应在土2℃以内。采用合适的校准技术对施用率进行校验。又 对于颗粒状或种子敷料等特殊剂型，可采用惯用的农业施用方式。饲料需在喷洒完成后添加。 8.5 试验步骤 8.5.1试验条件 8.5.1.1试验平均温度应为20℃士1℃，试验温度范围为20℃士2℃。试验容器区域的光照度为 4001x～8001x之间，昼夜交替（理想状态下各为12h）。 8.5.1.2为了测试土壤湿度，需要分别在试验开始时、过程中及结束阶段对试验容器进行称重。如质量损失超过了2%，则应添加去离子水以弥补流失的水分。值得注意的是，在试验孵化设备中保持较高的空气湿度（大于80%），可以有效减少水分的流失。 8.5.1.3在预试验和正式试验的开始和结束阶段均应测试pH值。采用与试验培养环境相同的制备和保存方式，在各个浓度组之外，额外准备一组空白对照和一组经处理土壤样本（均未添加跳虫），进行 pH值测试。
4 GB/T35522—2017
8.5.2试验步骤和测试 8.5.2.1对于每一个试验浓度，向试验容器中加人30g鲜重的测试土壤。同时制备不含受试物质的水空白对照样品。如在施用受试物质过程中使用了某种介质，那么还应对该介质的对照进行测试。溶剂或分散剂的浓度应在各试验测试组中保持一致。 8.5.2.2将跳虫小心地逐个移人每个试验容器（随机分配），并放置在土壤的表面。可以采用一个低流速的气流装置来提高转移效率。每个试验浓度和空白对照组的平行数取决于试验设计方案。在试验孵化箱中随机摆放试验容器，并每周随机更换容器在孵化箱中的位置。 8.5.2.3每个试验容器中应包括20只出生23d～26d的F.fimetaria，雄雌对半。在试验的第21天，从土壤中分离出跳虫并计数。对同一批次试验动物可通过个体大小来辨别F.fimetaria的性别。雕虫个体显著大于雄虫（参见附录D)。 8.5.2.4对于F.candida试验，每个试验容器中应加入10只出生9d～12d的跳虫。在试验的第28 天，从土壤中取出跳虫并计数。 8.5.2.5试验开始时及之后的2周，向每个试验容器中投放足量的饲料（如2mg～10mg）。饲料为市售的颗粒状的干酵母粉。 8.5.2.6试验结束时，将大约3周（F.fimetaria）或4周（F.candida）跳虫从土壤中取出并计数（见附录 E)，计算跳虫的死亡率和繁殖率。没有提取出的跳虫则被记录为死亡。提取和计数方法应经过验证验证方法比如在土壤中加人一定数目的跳虫，看该方法取出率是否大于已知投放数量的95%。 8.5.2.7试验操作过程中的记录表格见附录C。 8.5.3试验设计 8.5.3.1预试验 8.5.3.1.1必要时应进行预试验以确定试验浓度范围，如分成0.1mg/kg、1.0mg/kg、10mg/kg、 100mg/kg和1000mg/kg（土壤干重）的5个试验浓度，每个浓度两个平行样和空白对照。另外，还可以通过结构相似的化合物的试验结果，或是来自文献的跳虫死亡率或繁殖率等信息，作为判定浓度范围的依据，从而确定试验浓度。 8.5.3.1.2预试验的试验周期一般对于F.fimetaria为四周、F.candida为三周，确保未发育的幼虫为同一批次出生的。试验结束时，计算跳虫的死亡率和繁殖率，并记录发育成熟和出生幼虫的个体数。 8.5.3.2正式试验 8.5.3.2.1需要测试12个试验浓度以确定EC.（如EC。和半数效应浓度ECso）。建议每个试验浓度至少需2个平行样，空白对照需6个平行样。几何级数倍数系数取决于剂量-反应模型。 8.5.3.2.2为确定NOEC/LOEC值，至少需要5个几何级数倍数关系的试验浓度。建议每个试验浓度需4个平行样，空白对照8个平行样。浓度组间浓度几何倍数不得高于1.8。 8.5.3.2.3可采用一种综合试验方法同时确定EC、NOEC/LOEC。如采用此试验法，应至少需要8个几何级数倍数关系的试验浓度。建议每个试验浓度需4个平行样，空白对照8个平行样。浓度组间几何倍数不得高于1.8。 8.5.3.2.4如预试验在最高浓度下（即1000mg/kg土壤）未观察到显著效应，则可繁殖试验时进行限度试验，使用1000mg/kg浓度和空白对照进行试验。限度试验可用以证明在限定的试验浓度内不会产生显著的影响。处理组和空白组各需8个平行样。
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