ICS 13.300;11.100 A 80
GB
中华人民共和国国家标准
GB/T355212017
化学品 胚胎毒性植入后大鼠全胚胎培养法
ChemicalsEmbryotoxicityPost-implantation embryo culture tes
2018-07-01实施
2017-12-29发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局
中国国家标准化管理委员会 发布 GB/T 35521—2017
前言
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由全国危险化学品管理标准化技术委员会（SAC/TC251)提出并归口。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、宁波出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：李海山、崔媛、韩辉、陈会明、陈小青、程艳、艾文超、谢文平。
一 GB/T35521—2017
化学品胚胎毒性植入后大鼠全胚胎培养法
1范围
本标准规定了植人后大鼠全胚胎培养方法检测化学品胚胎毒性的术语和定义、试验原理、试验方法、终点描述、质量控制、数据分析和评价。
本标准适用于应用植人后大鼠全胚胎培养法检测化学品的胚胎毒性。本标准也可作为药物、消费品、农业用化学品、食品添加剂和污染物胚胎毒性检测的参考方法，
术语和定义
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下列术语和定义适用于本文件。
2.1
半数致畸浓度IC5o for malformations ICs0 50%的胚胎出现畸形的受试物浓度
2.2
3T3细胞半数生长抑制浓度IC50 for inhibition of the growth of 3T3 cells IC50(3T3) 50%的3T3细胞生长受抑制的受试物浓度。
2.3
最大致畸浓度ICmax for malformations ICmax 最大比率出现畸形的受试物最低浓度。
2.4
总体形态学评分无效应浓度ICNOEC for total morphological score ICNOEC TMS 对总体形态学评分未见异常效应的最高浓度
3 ：试验原理
含有1个～5个体节的大鼠胚胎在48h培养后，其生长发育和形态分化与体内同龄胚胎相似，且此时期的胚胎处于器官形成期，对外源化学物敏感。转瓶培养有利于胚胎培养液与其上方的气体交换。 由于胚胎发育对于氧气的需要越来越大，气体交换对于培养液的最佳氧饱和度非常重要。测试完成后，评估胚胎的形态，将对照组和实验组的胚胎进行比较，得到受试物胚胎毒性结果。
4试验方法
4.1 仪器设备
使用设备和器具如下：
1 GB/T35521—2017
体视显微镜； —镊子；一手术剪；一移液器；
培养皿：直径约100mm；带旋转设备的37℃培养箱（宜内带观察显微镜）；旋转培养瓶：容量至少10mL。
4.2试剂和材料 4.2.1大鼠 4.2.1.1用0.03mg/L、0.1mg/L、0.3mg/L和1mg/L的5-氟尿嘧啶进行阳性对照实验，1000mg/L 的青霉素G钠进行阴性对照实验，通过了阳性和阴性对照化合物的质量检查，并且有足够胚胎数目的大鼠品系可用于本标准。 4.2.1.2大鼠在温度20℃～24℃，湿度50%～70%的SPF级动物房中饲养，自由进食，不限饮水， 4.2.1.3 3每天检查大鼠的一般行为，保持其健康。7周龄～10周龄、未经产雌鼠至少适应2周后，与至少10周龄的雄鼠交配。用于制备血清的雄鼠体重应不低于250g。 4.2.2 化合物和培养液
使用的化合物和培养液如下：
Hank's平衡盐溶液（HBSS)：含0.185g/L的CaCl2，8.0g/L的NaCl,0.4g/L的KCl,0.2g/L的 MgSO+，0.308g/L的NaHCO3，1.0g/L的葡萄糖，0.075g/L的Na2HPO，0.060g/L的 KH,PO，6℃保存，以上试剂均为分析纯；二甲基亚砜（DMSO，分析纯）；乙醇（分析纯）；一二氧化碳（CO2，工业级）； —5-氟尿嘧啶；
-
青霉素G钠；无菌真空采血管。
4.2.3血清制备
雄性大鼠采用CO，麻醇后，打开腹腔，找到主动脉，用无菌真空采血管从主动脉收集血液，在1min 之内完成。1800r/min离心5min后吸取血清于冰上保存。采集完所有样品后，再次于1800r/min 离心3min，收集血清，于56℃热灭活30min。一20℃储存备用，使用前于37℃热融。 4.3 测试过程 4.3.1 交配过程
雌性大鼠饲养在12h/12h明暗交替的环境中，上午6时至下午6时为暗。下午4时至6时，将发情的未经产的雌鼠与雄鼠合笼，次日清晨分笼， 4.3.2分离胚胎
妊娠第10天上午（合笼当天为第0天），CO2麻醉致死，腹腔壁切口分离子宫，转移至手术板。用无菌的镊子和剪刀从子宫里分离蜕膜上的胚胎。把独立的胚胎转移到含有无菌HBSS的培养血中，在显
2 GB/T35521—2017
微镜下用无菌手术镊子小心放入去掉蜕膜组织的赖歇特膜和卵黄囊壁，留下完整的内卵黄囊。含有 1个～5个体节的胚胎将用于试验。 4.3.3受试物制备
每个胚胎培养中加人2mL大鼠血清。采用合适的溶剂溶解化合物（例如HBSS、DMSO或乙醇）。 在胚胎置入培养瓶之前，向培养血清中加入标准体积的化合物溶液，对照组中加人同体积的溶剂。加入溶液的体积已在预试验中证明不会干扰培养瓶中胚胎的发育。培养瓶中溶剂的最大浓度是1%水相溶液（HBSS），0.125%的DMSO，以及0.2%的乙醇。培养瓶通气后，将胚胎放入培养瓶中。每个母体的胚胎被尽可能均匀的分布在对照组和各个实验组中，并且尽可能保证平均每个浓度组的胚胎的起始体节数一致。受试化合物浓度梯度和平行对照的数目相当，并且同时进行测试。 4.3.4培养条件
胚胎在37℃条件下.以20r/min～40r/min转速不间断旋转，无菌培养48h。培养瓶每天两次通
氧，每次通氧时间30s，而且随着培养时间的增长，通氧气体中的氧气含量不断增加。通氧计划表（见表1) 给出了一个示例，不同实验室的最佳通氧条件会有所不同。如果37℃培养箱中带有观察用的显微镜，可在培养后0h一5h一21h一28h一45h时，通过判断尾端神经管封闭、胚胎弯曲、卵黄囊循环和心跳频率（见附录A)来检查胚胎完整性。胚胎放入培养瓶的时刻定为0h。
表1通氧计划表
气体浓度/%
培养时间/
CO: 5 5 5 5 5
h 0 5 21 28 45
02 5 10 20 20 40
Nz 90 85 75 75 55
4.3.5剂量-效应评估
受试物浓度采用十倍稀释的剂量间隔，每个剂量3个胚胎，来寻找毒性作用范围。然后，采用总体形态学评分（TMS)作为效应参数，在最高无效应浓度、TMS比对照减少至少50%的浓度，以及两个中间浓度时进行测试，每个浓度7个胚胎，以区分特异性胚胎毒性和一般的发育退缓。测试浓度间隔因子最小为2。任何化合物的最高测试浓度为1000mg/L，如果在此浓度下7个胚胎都没有产生效应，那么不需要进行其他浓度的测试。
5 终点描述
5.1 实验终点和终点检测 5.1.1 大鼠胚胎形态：按照图1所示观察形态变化（胚胎总体观察，包括体节个数，分化滞后，特定的畸形)。 5.1.2 ：大鼠胚胎功能：功能变化（心脏搏动，卵黄囊循环和尿囊循环）。 5.1.3 大鼠胚胎发育：胚胎生长发育（卵黄囊直径，冠臀长，头长）。
3 GB/T35521—2017
5.1.4细胞成活力：细胞成活（心脏搏动，卵黄囊循环和尿囊循环）。
前脑，后肢芽
中脑后脑上鄂突
a
AB O
感光系统一耳系统
觉系统心脏一体节形成
门
前肢芽
图1胚胎的形态
5.2终点检测值
畸形检测ICso和ICmax;以TMS计算ICNOECTMS 。 5.3终点测试 5.3.1培养48h后胚胎被转移至含有HBSS的培养皿中（37℃），按照附录B描述和确定生长发育情况。按照培养的顺序对胚胎进行评分，以减少胚胎之间培养时间长短的差异。 5.3.2用带有目镜测微尺的显微镜来测量卵黄囊直径，评价卵黄囊血管、卵黄囊循环和心脏搏动情况。 用显微外科镊取出卵黄囊，确定冠臀长、头长、体节数、胚胎弯曲情况和所有器官的形态学发展情况。一般把与前肢芽中部相对应的体节定为第9体节，由此开始向尾端方向计数体节数。按照附录B的方法对所有器官的总体形态学发育进行评分。对于处于发展过程中的中间阶段，可采用半分评分，例如生长处于阶段3和阶段4之间，可评分为3.5分。总体形态学参数包括培养后与培养前的体节数之差、 TMS。特定的畸形可能在任何一个形态学参数中出现，独立评分。所有器官的得分加在一起得到 TMS。与已列出的发育异常的形态学畸形情况需要单独标注。
6质量控制
6.1胚胎的质量检查
在培养之前，仔细检查卵黄囊的完整性和胚胎的形态。为了保证培养后胚胎的正常生长，需要同时进行不含受试物只含所用的溶剂的培养基对照组的平行实验。将对照组的生长情况与同实验室的以往对照组进行比较，以评价对照组的生长情况正常与否。对照组出现形态异常的最大机率为15%（即7 个中有1个异常）。 6.2 测试过程的质量控制
在进行受试物实验之前，用0.03mg/L、0.1mg/L、0.3mg/L和1mg/L的5-氟尿嘧啶进行阳性对照实验，1000mg/L的青霉素G钠进行阴性对照实验。
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