ICS13.300;13.020.40 A 80
GB
中华人民共和国国家标准
GB/T30665—2014
化学品 海水中的生物
降解性 密闭瓶法
Chemicals-Biodegradability in seawater-Closed bottle method
2015-04-30实施
2014-12-31发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局
中国国家标准化管理委员会 发布 GB/T30665—2014
目 次
前言 1 范围 2 规范性引用文件 3 术语和定义 N
受试物资料 5 方法原理
..
试验材料 6.1 仪器设备 6.2 参比物 6.3 海水 6.4 培养基 6.5 接种物 7试验程序 7.1组别设计 7.2试验操作 7.3样品测定质量控制
6
8
数据与报告
9
9.1数据记录 9.2数据处理 9.3结果报告附录A（资料性附录） 海水中的生物降解性附录B（资料性附录）海水盐度、温度和饱和溶解氧的关系附录C（资料性附录） 数据记录表附录D(资料性附录) 理论生化需氧量的计算参考文献
10 11 13 15 GB/T30665—2014
前言
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准与经济合作与发展组织（OECD)化学品测试导则No.306（1992年）《海水生物降解性》中的
“密闭瓶法”一章（英文版）技术性内容一致。
本标准做了下列结构和编辑性改动：
将引言、应用、方法选择和方法重现性说明归入附录A；一增加了术语和定义；一将计量单位改为我国法定计量单位。 本标准由全国危险化学品管理标准化技术委员会（SAC/TC251)提出并归口。 本标准起草单位：环境保护部化学品登记中心、环境保护部南京环境科学研究所、沈阳化工研究院
有限公司安全评价中心、上海市环境科学研究院、上海市检测中心。
本标准主要起草人：周红、刘纯新、胡俊杰、周林军、刘济宁、石利利、蔡磊明、宋乐平、胡双庆、 赵华清。
I GB/T30665—2014
化学品海水中的生物
降解性密闭瓶法
1范围
本标准规定了海水生物降解性密闭瓶法的受试物资料、方法原理、试验材料、试验程序、质量控制、 数据与报告。
本标准适用于测试与评价水中溶解度至少为2mg/L的化学品在海水中的生物降解性。对于溶解度较低的物质，原则上可像挥发性化合物那样（如用超声波分散处理），参照本标准进行测试。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T27849化学品降解筛选试验化学需氧量
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
生化需氧量 biochemical oxygendemand;BOD 微生物分解有机物所消耗氧的量，可表示为每毫克受试物消耗的氧气毫克数（mg/mg）。
3.2
化学需氧量 chemicaloxygendemand;COD 在强酸并加热条件下，一定量的重铬酸盐氧化水样中还原性物质所消耗氧化剂的量，可表示为每毫
克受试物消耗的氧气毫克数（mg/mg）。 3.3
理论需氧量theoreticaloxygendemand；ThOD 根据分子式计算得到的受试物完全被氧化需要的氧的总量，可表示为每毫克受试物消耗的氧气毫
克数（mg/mg）。 3.4
停滞期lagphase;LP 试验开始到降解率达到10%的时期，即微生物的适应期。
3.5
50%降解时间50percentdegradation;t50 从停滞期结束点算起到降解50%所用的时间。
4受试物资料
受试物资料包括：
1 GB/T30665—2014
分子式；纯度；主要成分组成比例； ThOD或者COD; 水溶解度；微生物毒性"；水解性；吸附性；水溶液中定量分析方法。
5方法原理
将含受试物浓度通常为2mg/L～10mg/L的海水试验培养液完全充满密闭瓶，在黑暗和15℃～~ 20℃（士1℃）的恒温条件下（温度范围可根据实际情况适当调整），28d内定期测定密闭瓶中的溶解氧含量，根据溶解氧的消耗计算化学品的生物降解率。本方法的优缺点参见附录A。
6试验材料
6.1 仪器设备
仪器设备包括：
具塞BOD瓶（250mL300mL）；水浴或培养箱（士1℃）；大烧杯（2L5L）；溶解氧测定仪； 0.2μm~0.45μm滤膜及过滤器（可选）；其他化学分析仪器（可选）。
6.2参比物
本标准推荐苯胺（新蒸馏）、乙酸钠或苯甲酸钠作为参比物。若使用其他参比物，其在短期内应至少降解60%（以ThOD计），并在试验报告中加以说明。 6.3海水 6.3.1海水的采集
选择合适取样地点，采集海水样品并在1d～2d内送至实验室保存。运输过程中的温度不应显著高于试验温度。 6.3.2记录海水样品采集的相关信息
记录采样点位置信息、海水污染状况及营养状况，对于近海或受污染水域的样品，应确定异养微生物菌落数、硝酸盐、铵盐和磷酸盐的浓度。同时应记录下列信息：
采样时间； 1参见参考文献[1]。 2 GB/T30665—2014
一采样深度；一表观(如浊度等)；一温度；
盐度；
-
—溶解有机碳（dissolvedorganiccarbon;DOC)；一一从采样到试验的样品保存时间。
6.3.3海水的老化和预处理
当海水样品中DOC浓度较高，或者估计28d后空白组BOD值可能高于程序对照组30%时，试验前应对海水进行约一周的老化。在试验温度、黑暗或散射光与有氧条件下（必要时轻轻搅拌），老化约周，以去除过多的DOC。试验前可用尼龙滤网或滤纸（不应用膜或GF-C过滤器）过滤，或通过沉淀，去除海水样品中的颗粒物。 6.4培养基 6.4.1试验培养基贮备液
用分析纯试剂制备下列贮备液：
磷酸缓冲液：称取8.50g磷酸二氢钾（KHzPO4）、21.75g磷酸氢二钾（KzHPO4）、33.30g二水合磷酸氢二钠（NazHPO，·2HzO)和0.50g氯化铵（NH4CI)，用蒸馏水溶解，定容至1L。 氯化钙溶液：称取27.50g无水氯化钙（CaCl2），用蒸馏水溶解，定容至1L。 硫酸镁溶液：称取22.50g七水合硫酸镁（MgSO，·7H.O），用蒸馏水溶解，定容至1L。 氯化铁溶液：称取0.25g六水合氯化铁（FeCl·6H2O），用蒸馏水溶解，定容至1L。通过每升滴加1滴浓盐酸或加0.4g乙二胺四乙酸的二钠盐（EDTA二钠盐）预防沉淀发生。如果发生沉淀，应重新配制。
-
6.4.2试验培养基的制备
取6.4.1中贮备液各1mL于800mL海水中，用海水定容至1L。定容后的溶液在试验温度下高强度曝气20min。静置片刻后测定海水培养基中溶解氧浓度。当海水盐度为3.2%时，15℃和20℃下海水培养基的饱和溶解氧浓度为8.1mg/L和7.4mg/L。 6.5接种物
试验培养基中除海水中自有微生物外，不加入特定接种物。必要时采用海水琼脂平板计数法，确定试验培养基中异养微生物的菌落数，尤其是对于近海或受污染海域的海水样品。通过含有参比物的对照组检验海水中异养微生物的活性。
7试验程序
7.1 组别设计 7.1.1通常，试验设置三个组别：
-至少8个含受试物BOD瓶的试验组；一至少8个仅含接种物BOD瓶的空白对照组；
至少8个含参比物BOD瓶的程序对照组。
-
7.1.2存在微生物抑制作用时，增加6个含受试物和参比物BOD瓶的毒性对照组。
3 GB/T30665—2014
7.1.3若进行受试物的特定化学分析，可以增加理化对照组（非生物对照组），以检查是否发生了非生物降解或损耗，如水解或吸附。 7.1.4每个组至少含二个平行。试验期间至少进行4次溶解氧测定（第0d、第5d、第15d和第28d)。 按溶解氧测定和特定化学分析（可选）所需确定BOD瓶数量。若只设试验组、空白对照组和程序对照组，则至少需要3×2×4=24个BOD瓶。 7.2试验操作 7.2.1所有试验操作，包括海水老化和预处理都应该在15℃～20℃、洁净的环境下进行，玻璃器血应确保洁净但无需灭菌。 7.2.2统一在大烧杯中准备受试溶液。针对试验组，先在大烧杯中加人适量的受试物或其贮备液。程序对照组中加人参比物或其贮备液。毒性对照组中同时加人受试物和参比物或其贮备液。非生物对照组中，加受试物质或其贮备液的同时，为抑制微生物活性，可以加人二氯化汞，二氯化汞最终浓度为 50mg/L～100mg/L。加入的若为受试物或参比物的贮备液，海水培养基中盐度不应有较大变化。
注意：二氯化汞毒性很大，操作时应谨慎。含二氯化汞的废液应按规定妥善处理，不能直接排入下水道。 7.2.3再在大烧杯中加人一定量试验培养基使参比物或受试物质达到一定浓度。设置受试物和参比物的初始浓度时应该考虑：常见温度和盐度下海水的溶解氧浓度（参见附录B)、BOD值以及估计的受试物生物降解性。盐度为3.2%的海水15℃和20℃时，饱和溶解氧分别约为8.1mg/L和7.4mg/L。 如果海水没有老化，海水自身的耗氧量（一次空白呼吸）可能为2mg/L或更多。因此，为了确保受试物氧化后还有一定的含氧量，对于试验条件下易完全降解的化合物（如参比物），其初始浓度一般为 2mg/L～3mg/L(视ThOD而定）；对不易降解且无生物毒性的化合物，浓度可设置为10mg/L。若同时设一个低浓度组（约2mg/L～3mg/L）和一个高浓度组（10mg/L），可能对试验会有帮助。空白对照组，大烧杯中仅加人试验培养基。 7.2.4将软管插到各组大烧杯，从距底部1/4处（不要从底部）吸取其中溶液至对应组BOD瓶中，并使 BOD瓶完全充满。立即测量O时刻溶解氧，或加人二氯化锰（MnCl2）和氢氧化钠（NaOH)形成沉淀保存，以备日后化学分析。其余BOD瓶放入培养箱中，在15℃～20℃及黑暗条件下培养。 7.3样品测定 7.3.1在28d培养期中，以适合的时间间隔（至少在5d、15d和28d)从各试验组抽取至少两瓶进行溶解氧测定。 7.3.2溶解氧可用我国标准或国际标准的化学或电化学方法测定。 7.3.3着进行受试物的特定化学分析，样品应先经微孔滤膜过滤（0.2m～0.45μm滤膜）或离心分离 15min。如不能当天分析，可在2℃～4℃下保存48h或在一18℃下保存更长时间（若已知受试物不会受到影响，保存前可酸化至pH值为2）。
8质量控制
质量控制应做到：
参比物苯甲酸钠停滞期和50%降解时间分别为0d～2d和1d～4d；苯胺停滞期和50%降解时间分别为0d～7d和2d～12d。 试验期间，空白组溶解氧消耗不高于试验组的30%。 若毒性对照组BOD低于试验组与程序对照组BOD之和，表明该浓度下受试物对接种物有毒性作用，应降低受试物浓度。
- -
4 GB/T30665—2014
应考虑含氮化合物对试验结果可能的影响，受试物的纯度或主要成分的相对比例有助于解释试验结果，尤其是当结果接近通过水平时。 由于试验中受试物的浓度一般都高于自然界中的浓度，因此受试物与其他碳源物质的浓度比值未必适宜。所以本方法作为初筛方法，只用于判断受试物是否容易发生生物降解。若测定结果较低，并不表明该受试物不能在海洋环境中降解，只是表明需要做进一步的工作来确定。
9数据与报告
9.1数据记录
如实记录试验操作信息及分析数据，格式参见附录C。
9.2数据处理 9.2.1＇首先用每一时间点试验组的溶解氧消耗减去相应的空白对照组的溶解氧消耗，除以试验组的受试物浓度，得到BOD[见式(1)和式(2)。式(1)和式(2)的区别在于式(1)适用于第0d空白组的溶解氧含量等于第Od试验组的溶解氧含量的特殊情况]，再用此BOD除以ThOD或者COD就得到生物降解百分率[见式(3)和式（4)]。除以ThOD或者COD得到的降解率可能不同，优先使用前者。ThOD 和COD的计算和确定参见附录D。
(1)
BOD=m-m:
c
式中： BOD- 生化需氧量，单位为毫克每毫克（mg/mg）；
空白组的溶解氧含量，单位为毫克每升（mg/L）；试验组的溶解氧含量，单位为毫克每升（mg/L）；试验组的受试物质浓度，单位为毫克每升（mg/L）。
mb mt c
[mt(0) -m t(r)] -[mb(0) mb(r) ]
BOD=
(2)
c
式中： BOD 生化需氧量，单位为毫克每毫克（mg/mg）； m b(o) 第0天空白组的溶解氧含量，单位为毫克每升（mg/L)；
第0天试验组的溶解氧含量，单位为毫克每升（mg/L）；
m t(o) mb(z) 第天空白组的溶解氧含量，单位为毫克每升（mg/L）；
第天试验组的溶解氧含量，单位为毫克每升（mg/L)；试验组的受试物质浓度，单位为毫克每升（mg/L）。
mt(r) c
BOD
(3)
D =
ThOD×100
式中： D BOD ThOD 理论需氧量，单位为毫克每毫克（mg/mg）。
降解率，%；生化需氧量，单位为毫克每毫克（mg/mg）；
BOD
D:
X 100
·(4)
COD
式中： D
降解率，%；
5