ICS 07.030 CCS A43
GB
中华人民共和国国家标准化指导性技术文件
GB/Z42840--2023/ISO/TS16550.2014
纳米技术 利用金黄色葡萄球菌释放的
胞壁酸检测银纳米颗粒的效力
Nanotechonologies---Determination of silver nanopartiles poteney hy release of
muramic acid from Staphrlococcus aureus
(IS0/TS16550.2014,IDYT)
2023-08-06实施
2023-08-06发布
国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会
发布 GB/142840--2023/1S0/TS185502014
目 次
寳
1 魔阁 2 爱摄性扒用文件 3 术诺和定义垂 特母和炫略浴 $6 5 蒙科 3 MA技到的样品减备 ,2 尚生长和A处题 6.2 纯康爱水饼就 塑陈盛精生化 8星凯箱色谱-爱落？蒙据分新和结果耀鞋容粮纳来颗粒样品酷检测法时A（赞料性） 气相色滋摄滋送附豪B（资料性） 内标韩最C《资料经） 凝纳来额粒备比物质的实验室销备方法附蒙D资精性） 超锦米乐餐龙滚备附爱E（资科性） 对照多件剪处理：阳经对雕，团生对照，烟菌道皮性胜照谢老文就
R
10
11 12 13
4
AAN GB/Z42840-2023/1SO/TS16550.2014
前言
本文件按照GB/T1.1--2020标准化工作导则第1部分，标准化文件的结构想超草规赠的规定想章
本文件等岗采用ISO/TS16550：2014《纳来技术利用金黄色霸郁球蓄释放的离壁酸检测镀纳米要粒的效力》，文件类微由ISO的技术规范调整为我国的措导性技术文件。
本文件增加了“规范健引用文件”章。 本文件散了下列最小限度的翁辑性改动： --将第7章“三个平行样的标准偏差为士0.0128"翼到该章的表2中。 本文件由中瑞科学院凝出。 本文件自全国纳来技术标摊化技术委员会（SAC/TC279）归口。 本文件起草单位：中国医学科学院基柏医学研究所。 本文件主要超举人：刘范、许擦、温游。 G81Z.428400-2023/15071910550:2014
引富
微幼来藏教（ANP）的抗商活性日教越来越需地童用子生馨胜药模实发欢多消费品中，加医疗器械除汉材科，餐科戏做科故人材精，创悠旗用意部鞋料，防品基医流衣机学，企业生产爱多种具有不间物鞋做性的象来接奖作为抗新别，低极少关注高前作用，此外，的米腻整在不尚不发中的生餐利用庭育会请加，从面会财土携有益教生想，核的，物我人类我成感哦辅质照。国，优赖浓题的教力宜#馨其疑慈的生静活性进行评估和分觉。
本文祥莎及财爆教给料特性的馨话 GB/Z42840-m2023/150/T516550:2014
纳米技术利用金黄色葡萄球菌释放的
跑壁酸检银纳米粒的效力
1葱园
本文件指选了一种利用气相色诺质谐法（GC-MS）定爱评价银纳米竭妆引趣金色赢翻球装维购整降解及照登駿放效方的方法。
2规莞性用文件
本文件设有热范性用文件。
3术语事定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
抗商活丝antibactericalactivity 化合最赠质茶灰细菌（果菌性）酸抑细剪生长（抑菌性）的性题
3.2
就森光散射！ dynanie light zcattariug;DLS 光子相关光潜法photoncorrelstionspectroscopy 能用子检测暑接中小题粒或接液中臻合物的教径分布况的一种物理技术。
3.3
气橱色谱-微谱法 gas chromatography-mass apectromatry:G-MS 培合气相色谱法和质谱分析法定性和定意分析待滋祥品中挥发性化合物的技术（见附录A）
3.4
草兰氏期藍Graupositive bacteria 在草兰氏菜色法中，被樂色不被有机菜剂脱色的氧菌。
3.5
肉锅internal stsuiard 项人制牌品中费脂定性整新和/双定量测定牌品减分的巴第浓魔化合（见谢录B）。 ［来源1S020752:2014,32]
3.6
骏出limnof deiction：Lon 由协作试验或其您的适当验证所证期的，能被可靠检出但不婴求能被定量的诞试样品中被测费的
最低爱或浓度：
东源1308196-1.2009,3.4.3]
l GB/Z42840--2023/1S0/1518550:2014
3.7
定JiitargntificaoaL 由换作试验或真悠装证所证明内，在方法所模定的实装条件下然教在可按爱的精密发和推秘皮水
乳下定景微的刻诚祥语中闲标的爱低德度，
[来#15015216-1.2017.3.18]
3.8
烧验泰范器Hneardynaicringe：LIY 丫时Y的国妇#美品意城的花照生的教佳国妇装医好美方中的系事
3.9
建院 mtnmoleacid 在化学结构上出题与靠莫糖胶以随健盗接形成的种精既感，在肤家精中以N-Z感衡生游式
天就存在
注1:3-0-元载Z基-0-数嘴格岁。 #15）。
GeNAs MaNAc
as
ONA
MuMAeL l GloNAa
L-Aka
HO
OlnA
0m
L-Al I-Ch CHNA D-Cle i9s D-tys D-As Do-la
Als D-33e Btys D-Ls I2-Ak D-Ak
HsC
H
0饿1送0
慕装的罐荐
欢精
密1 联发脑酸的构
3.10
KWpidoriyanPGN 壁质由精和狐花装姐意的来合整在菌细脑幕外感网状层构成细电堂注：欢意销是儿乎所有留商维监盛中所特有和易微的一种魔分，在家兰民期性菌领服意中大量查在，更医1心，
3.11
婴纯来教教力siernopartelepoteane 保纳米飘教与解剪磨感的成应超方：遵过随然胶释放间接松游
3.12
黄色药球换性天氧草兰送财性球菌，通美两性，在最意您下量新费电状，能在以甘游尊为唯添的高效
培养基中生长，产生靠包色囊。 3.13
真素摄充每亮升（/mL）量摄或更优的浓度。
2 GB/Z42840—2023/ISO/TS16550:2014
3.14
透射电子显微镜transmissionelectronmicroscopy;TEM 利用穿过样品并与之发生相互作用的电子束产生样品放大图像或衍射花样的仪器。 ［来源：GB/T30543—2014，3.8，有修改］
3.15
紫外可见光谱ultravioletvisiblespectroscopy；UV-Vis 在紫外-可见光谱区的吸收光谱或反射光谱。 注：这意味着它使用可见光及其毗邻范围近紫外和近红外（NIR)J的光。
3.16
X射线衍射法 X-raydiffraction;XRD 通过分析X射线轰击样品产生的衍射花样获得样品晶体结构信息的方法。 ［来源：GB/T30544.6—2016,5.2.1]
4符号和缩略语
下列符号和缩略语适用于本文件。 AgNP：银纳米颗粒（SilverNanoparticle） MA：胞壁酸(MuramicAcid) MHB：米勒-海顿肉汤（MuellerHintonBroth） ODso：600nm处光密度（OpticalDensityat600nm） SIM：选择性离子检测（SelectedIonMonitoring）
5原理
肽聚糖(PGN)是细菌细胞壁特有且必需的一种成分[12]，其主要结构特征是由短肽交联的线状聚糖链。在金黄色葡萄球菌中，聚糖链由N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸残基通过β-1-4键交替连接组成；肽链由L-丙氨酸、D-谷氨酰胺、L-赖氨酸、D-丙氨酸组成[图1a)J[12][13]。研究表明AgNP能破坏细菌细胞壁，产生PGN片段，导致培养基中胞壁酸浓度上升[12114]。
AgNP是胶体AgNP的活性成分，在不同的商品中，AgNP可能具有不同大小、表面特征、形状， zeta电位、浓度。AgNP的活性取决于以上特征，这些特征能表现出协同或拮抗的交互作用[14]。区别每种特征所造成的影响需要制备大量的样品并使用多种设备。监测MA的浓度是反映这些特征影响 AgNP效力的一项指标[14][15][16][17][18]。
本文件采用一种非常灵敏的方法检测单一分析物一一胞壁酸，作为细胞壁降解这一单一作用模式
的间接测量法。该方法的灵敏度允许在最低抑菌浓度（MIC)以下对胞壁酸进行定量[19TE20]。但是，通过胞壁酸的释放检测AgNP的作用并不反映其杀伤细胞或阻滞细胞生长的能力。
此外，该方法依靠单一实验室合成的参比样品来建立一个被广泛接受的剂量响应曲线用于后续使用。纳米颗粒具有颗粒-化学物质二象性，即颗粒也是通过溶解过程释放化学物质的储存库。本文件中描述的方案不提供关于银纳米颗粒广谱杀菌作用的信息
由对金黄色葡萄球菌的作用效果并不能预测对其他革兰氏阳性菌的作用效果，也不适用于革兰氏
阴性菌，因为两种类型的细胞壁存在巨大的结构差异，肽聚糖的比例也完全不同。因此，本文件不是关于纳米颗粒对细菌作用的全面考察。
基于这些考虑，实验室制备的银纳米颗粒和系统验证参比材料的表征数据见附录C。
3 GB/Z42840-—2023/ISO/TS16550:2014
6MA检测的样品制备
6.1细菌生长和AgNP处理 6.1.1检测方法原理
金黄色葡萄球菌ATCC25923培养于新鲜肉汤培养基中，当OD6oo达到约0.45～0.5（即细菌培养至接近1×10°CFU/mL～2×109CFU/mL或处于对数生长中期）时，加人AgNP，37℃振荡（180r/min～200r/min）孵育18h。收集培养基，通过离心和过滤处理培养液，利用旋转蒸发器和冷冻干燥机进行干燥。下一步将采用本文件所描述的方法检测胞壁酸的浓度。本实验中使用的培养物中需含有高滴度的活菌。在每次实验中，至少宜通过已有的细菌生长曲线参照数据或通过在一段时间范围内测定ODsoo值来确定具有高滴度的活菌（ODsoo约在0.45～0.5）。 6.1.2方法 6.1.2.1材料
检测材料包括金黄色葡萄球菌ATCC25923；
-MHB培养基。
6.1.2.2 检测条件
通过以下步骤进行检测。 1） 通过在营养琼脂（NA)平板上挑取单一细菌集落来制备细菌的新鲜培养液。 2） 用于检测银纳米颗粒浓度的每个样品宜分装到3个烧瓶（150mL～200mL）中，每瓶装有
25mL无菌MHB培养基。 3） 细菌接种至锥形瓶前，宜先在MHB培养基中预培养2h～3h。在含5mLMHB培养基的试
管中接种单个菌落，37℃振荡培养使浊度等同于1号麦克法兰比浊管。要得到20mL细菌悬液，需将0.1mL的预培养液加人到含20mLMHB培养基的无菌100mL锥形瓶中，并在 37℃培养，使OD0o达到0.45～0.5（约1×10°CFU/mL～2X10°CFU/mL），或使细菌处于对数生长中期。这个建议的OD值是基于实验中根据ODsoo读数和相应的CFU计数绘制的生长曲线得到的。在无菌条件下，制备的细菌悬液应按照表1使用。
4）不宜使用处于静止生长期的细菌。 5）培养温度宜为37℃，振荡速度为180r/min～200r/min。
6.1.2.3溶剂/溶媒
使用粉末状AgNP时，溶剂/溶媒不宜与待测物质和细菌发生化学反应。宜尽可能首先考虑使用水溶性溶剂/溶媒（见附录D)。 6.1.2.4暴露浓度
至少采用5种不同剂量的测试样品（见表1）。
6.1.2.5步骤
基于6.1.2.2，金黄色葡萄球菌ATCC25923培养于MHB培养基中，在AgNP处理之前，接种
4 ICS 07.030 CCS A43
GB
中华人民共和国国家标准化指导性技术文件
GB/Z42840--2023/ISO/TS16550.2014
纳米技术 利用金黄色葡萄球菌释放的
胞壁酸检测银纳米颗粒的效力
Nanotechonologies---Determination of silver nanopartiles poteney hy release of
muramic acid from Staphrlococcus aureus
(IS0/TS16550.2014,IDYT)
2023-08-06实施
2023-08-06发布
国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会
发布 GB/142840--2023/1S0/TS185502014
目 次
寳
1 魔阁 2 爱摄性扒用文件 3 术诺和定义垂 特母和炫略浴 $6 5 蒙科 3 MA技到的样品减备 ,2 尚生长和A处题 6.2 纯康爱水饼就 塑陈盛精生化 8星凯箱色谱-爱落？蒙据分新和结果耀鞋容粮纳来颗粒样品酷检测法时A（赞料性） 气相色滋摄滋送附豪B（资料性） 内标韩最C《资料经） 凝纳来额粒备比物质的实验室销备方法附蒙D资精性） 超锦米乐餐龙滚备附爱E（资科性） 对照多件剪处理：阳经对雕，团生对照，烟菌道皮性胜照谢老文就
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AAN GB/Z42840-2023/1SO/TS16550.2014
前言
本文件按照GB/T1.1--2020标准化工作导则第1部分，标准化文件的结构想超草规赠的规定想章
本文件等岗采用ISO/TS16550：2014《纳来技术利用金黄色霸郁球蓄释放的离壁酸检测镀纳米要粒的效力》，文件类微由ISO的技术规范调整为我国的措导性技术文件。
本文件增加了“规范健引用文件”章。 本文件散了下列最小限度的翁辑性改动： --将第7章“三个平行样的标准偏差为士0.0128"翼到该章的表2中。 本文件由中瑞科学院凝出。 本文件自全国纳来技术标摊化技术委员会（SAC/TC279）归口。 本文件起草单位：中国医学科学院基柏医学研究所。 本文件主要超举人：刘范、许擦、温游。 G81Z.428400-2023/15071910550:2014
引富
微幼来藏教（ANP）的抗商活性日教越来越需地童用子生馨胜药模实发欢多消费品中，加医疗器械除汉材科，餐科戏做科故人材精，创悠旗用意部鞋料，防品基医流衣机学，企业生产爱多种具有不间物鞋做性的象来接奖作为抗新别，低极少关注高前作用，此外，的米腻整在不尚不发中的生餐利用庭育会请加，从面会财土携有益教生想，核的，物我人类我成感哦辅质照。国，优赖浓题的教力宜#馨其疑慈的生静活性进行评估和分觉。
本文祥莎及财爆教给料特性的馨话 GB/Z42840-m2023/150/T516550:2014
纳米技术利用金黄色葡萄球菌释放的
跑壁酸检银纳米粒的效力
1葱园
本文件指选了一种利用气相色诺质谐法（GC-MS）定爱评价银纳米竭妆引趣金色赢翻球装维购整降解及照登駿放效方的方法。
2规莞性用文件
本文件设有热范性用文件。
3术语事定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
抗商活丝antibactericalactivity 化合最赠质茶灰细菌（果菌性）酸抑细剪生长（抑菌性）的性题
3.2
就森光散射！ dynanie light zcattariug;DLS 光子相关光潜法photoncorrelstionspectroscopy 能用子检测暑接中小题粒或接液中臻合物的教径分布况的一种物理技术。
3.3
气橱色谱-微谱法 gas chromatography-mass apectromatry:G-MS 培合气相色谱法和质谱分析法定性和定意分析待滋祥品中挥发性化合物的技术（见附录A）
3.4
草兰氏期藍Graupositive bacteria 在草兰氏菜色法中，被樂色不被有机菜剂脱色的氧菌。
3.5
肉锅internal stsuiard 项人制牌品中费脂定性整新和/双定量测定牌品减分的巴第浓魔化合（见谢录B）。 ［来源1S020752:2014,32]
3.6
骏出limnof deiction：Lon 由协作试验或其您的适当验证所证期的，能被可靠检出但不婴求能被定量的诞试样品中被测费的
最低爱或浓度：
东源1308196-1.2009,3.4.3]
l GB/Z42840--2023/1S0/1518550:2014
3.7
定JiitargntificaoaL 由换作试验或真悠装证所证明内，在方法所模定的实装条件下然教在可按爱的精密发和推秘皮水
乳下定景微的刻诚祥语中闲标的爱低德度，
[来#15015216-1.2017.3.18]
3.8
烧验泰范器Hneardynaicringe：LIY 丫时Y的国妇#美品意城的花照生的教佳国妇装医好美方中的系事
3.9
建院 mtnmoleacid 在化学结构上出题与靠莫糖胶以随健盗接形成的种精既感，在肤家精中以N-Z感衡生游式
天就存在
注1:3-0-元载Z基-0-数嘴格岁。 #15）。
GeNAs MaNAc
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ONA
MuMAeL l GloNAa
L-Aka
HO
OlnA
0m
L-Al I-Ch CHNA D-Cle i9s D-tys D-As Do-la
Als D-33e Btys D-Ls I2-Ak D-Ak
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H
0饿1送0
慕装的罐荐
欢精
密1 联发脑酸的构
3.10
KWpidoriyanPGN 壁质由精和狐花装姐意的来合整在菌细脑幕外感网状层构成细电堂注：欢意销是儿乎所有留商维监盛中所特有和易微的一种魔分，在家兰民期性菌领服意中大量查在，更医1心，
3.11
婴纯来教教力siernopartelepoteane 保纳米飘教与解剪磨感的成应超方：遵过随然胶释放间接松游
3.12
黄色药球换性天氧草兰送财性球菌，通美两性，在最意您下量新费电状，能在以甘游尊为唯添的高效
培养基中生长，产生靠包色囊。 3.13
真素摄充每亮升（/mL）量摄或更优的浓度。
2 GB/Z42840—2023/ISO/TS16550:2014
3.14
透射电子显微镜transmissionelectronmicroscopy;TEM 利用穿过样品并与之发生相互作用的电子束产生样品放大图像或衍射花样的仪器。 ［来源：GB/T30543—2014，3.8，有修改］
3.15
紫外可见光谱ultravioletvisiblespectroscopy；UV-Vis 在紫外-可见光谱区的吸收光谱或反射光谱。 注：这意味着它使用可见光及其毗邻范围近紫外和近红外（NIR)J的光。
3.16
X射线衍射法 X-raydiffraction;XRD 通过分析X射线轰击样品产生的衍射花样获得样品晶体结构信息的方法。 ［来源：GB/T30544.6—2016,5.2.1]
4符号和缩略语
下列符号和缩略语适用于本文件。 AgNP：银纳米颗粒（SilverNanoparticle） MA：胞壁酸(MuramicAcid) MHB：米勒-海顿肉汤（MuellerHintonBroth） ODso：600nm处光密度（OpticalDensityat600nm） SIM：选择性离子检测（SelectedIonMonitoring）
5原理
肽聚糖(PGN)是细菌细胞壁特有且必需的一种成分[12]，其主要结构特征是由短肽交联的线状聚糖链。在金黄色葡萄球菌中，聚糖链由N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸残基通过β-1-4键交替连接组成；肽链由L-丙氨酸、D-谷氨酰胺、L-赖氨酸、D-丙氨酸组成[图1a)J[12][13]。研究表明AgNP能破坏细菌细胞壁，产生PGN片段，导致培养基中胞壁酸浓度上升[12114]。
AgNP是胶体AgNP的活性成分，在不同的商品中，AgNP可能具有不同大小、表面特征、形状， zeta电位、浓度。AgNP的活性取决于以上特征，这些特征能表现出协同或拮抗的交互作用[14]。区别每种特征所造成的影响需要制备大量的样品并使用多种设备。监测MA的浓度是反映这些特征影响 AgNP效力的一项指标[14][15][16][17][18]。
本文件采用一种非常灵敏的方法检测单一分析物一一胞壁酸，作为细胞壁降解这一单一作用模式
的间接测量法。该方法的灵敏度允许在最低抑菌浓度（MIC)以下对胞壁酸进行定量[19TE20]。但是，通过胞壁酸的释放检测AgNP的作用并不反映其杀伤细胞或阻滞细胞生长的能力。
此外，该方法依靠单一实验室合成的参比样品来建立一个被广泛接受的剂量响应曲线用于后续使用。纳米颗粒具有颗粒-化学物质二象性，即颗粒也是通过溶解过程释放化学物质的储存库。本文件中描述的方案不提供关于银纳米颗粒广谱杀菌作用的信息
由对金黄色葡萄球菌的作用效果并不能预测对其他革兰氏阳性菌的作用效果，也不适用于革兰氏
阴性菌，因为两种类型的细胞壁存在巨大的结构差异，肽聚糖的比例也完全不同。因此，本文件不是关于纳米颗粒对细菌作用的全面考察。
基于这些考虑，实验室制备的银纳米颗粒和系统验证参比材料的表征数据见附录C。
3 GB/Z42840-—2023/ISO/TS16550:2014
6MA检测的样品制备
6.1细菌生长和AgNP处理 6.1.1检测方法原理
金黄色葡萄球菌ATCC25923培养于新鲜肉汤培养基中，当OD6oo达到约0.45～0.5（即细菌培养至接近1×10°CFU/mL～2×109CFU/mL或处于对数生长中期）时，加人AgNP，37℃振荡（180r/min～200r/min）孵育18h。收集培养基，通过离心和过滤处理培养液，利用旋转蒸发器和冷冻干燥机进行干燥。下一步将采用本文件所描述的方法检测胞壁酸的浓度。本实验中使用的培养物中需含有高滴度的活菌。在每次实验中，至少宜通过已有的细菌生长曲线参照数据或通过在一段时间范围内测定ODsoo值来确定具有高滴度的活菌（ODsoo约在0.45～0.5）。 6.1.2方法 6.1.2.1材料
检测材料包括金黄色葡萄球菌ATCC25923；
-MHB培养基。
6.1.2.2 检测条件
通过以下步骤进行检测。 1） 通过在营养琼脂（NA)平板上挑取单一细菌集落来制备细菌的新鲜培养液。 2） 用于检测银纳米颗粒浓度的每个样品宜分装到3个烧瓶（150mL～200mL）中，每瓶装有
25mL无菌MHB培养基。 3） 细菌接种至锥形瓶前，宜先在MHB培养基中预培养2h～3h。在含5mLMHB培养基的试
管中接种单个菌落，37℃振荡培养使浊度等同于1号麦克法兰比浊管。要得到20mL细菌悬液，需将0.1mL的预培养液加人到含20mLMHB培养基的无菌100mL锥形瓶中，并在 37℃培养，使OD0o达到0.45～0.5（约1×10°CFU/mL～2X10°CFU/mL），或使细菌处于对数生长中期。这个建议的OD值是基于实验中根据ODsoo读数和相应的CFU计数绘制的生长曲线得到的。在无菌条件下，制备的细菌悬液应按照表1使用。
4）不宜使用处于静止生长期的细菌。 5）培养温度宜为37℃，振荡速度为180r/min～200r/min。
6.1.2.3溶剂/溶媒
使用粉末状AgNP时，溶剂/溶媒不宜与待测物质和细菌发生化学反应。宜尽可能首先考虑使用水溶性溶剂/溶媒（见附录D)。 6.1.2.4暴露浓度
至少采用5种不同剂量的测试样品（见表1）。
6.1.2.5步骤
基于6.1.2.2，金黄色葡萄球菌ATCC25923培养于MHB培养基中，在AgNP处理之前，接种
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