ICS 13.300 CCS A 80
GP
中华人民共和国国家标准
GB/T41622—2022
化学品 大黄蜂急性经口毒性试验
Chemicals-Bumblebee acute oraltoxicitytest
2023-02-01实施
2022-07-11发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会 发布 GB/T 41622—2022
前言
本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由全国危险化学品管理标准化技术委员会（SAC/TC251)提出并归口。 本文件起草单位：生态环境部固体废物与化学品管理技术中心、广东省微生物研究所、沈阳沈化院
测试技术有限公司、生态环境部南京环境科学研究所、上海市检测中心、上海化工院检测有限公司、上海市环境科学研究院、贵州省分析测试研究院。
本文件主要起草人：刘纯新、韦洪莲、桑宇、赵虎、梅承芳、杨海荣、窦从从、范德玲、舒耀皋、曾国驱、 陈晓倩、胡双庆、杨鸿波。
I GB/T41622—2022
引言
本文件描述了一种用于评估农药和其他化学品对成年大黄蜂工蜂急性经口毒性的实验室试验方法，以经济合作与发展组织(OECD)化学品测试导则No.213《密蜂，急性经口毒性试验》及相关研究为基础，在2014年由国际植物-授粉生物关系委员会（ICPPR)国际环比试验小组进行首次环比试验， 2015年由OECD国际环比试验小组进行第二次环比试验。在环比试验中使用了欧洲熊蜂（Bombus terrestris）和美洲东部熊蜂（Bombusimpatiens）。该试验方法也适用于其他种类的大黄蜂，但未见记录。
授粉昆虫（如大黄蜂）可通过接触（直接或间接传粉）或食用含有残留植物保护产品或其他化学品的食物而暴露于植物保护产品或其他化学品的残留物。为解决经口暴露于化学物质的潜在风险，可在实验室将成年大黄蜂工蜂暴露于相应的化学物质进行急性经口毒性研究。
为得到满足化学品监管要求的数据，在用本试验方法测试混合物之前，应考虑能否得到满足该目的的适当结果，以及为什么要得到这样的结果。当监管要求进行混合物试验时，则不用考虑这些，直接进行混合物试验。
在评价化学物质毒性过程中，当大黄蜂暴露于某种化学物质时，需要测定大黄蜂的急性经口毒性。 通过急性经口毒性试验，测定农药及其他化学物质对大黄蜂的固有毒性。应使用本试验的结果判断是否需要进一步评价。特别是，基于从实验室毒性试验到半田间试验和田间试验的顺序，这种方法可用于逐步评估化学品对授粉昆虫的风险。化学品以活性物质或配制产品的形式进行试验。
本方法的目的是测定成年工蜂单次暴露于某种化学品后的LD50。试验数据用于适当的授粉生物风险评估。在授粉生物总体风险评估方案体系中，本方法属于较低层级的试验。
= GB/T41622—2022
化学品大黄蜂急性经口毒性试验
1范围
本文件规定了化学品大黄蜂急性经口毒性试验的受试物信息、参比物、试验原理、试验准备、试验程序、质量保证与质量控制、数据与报告。
本文件适用于评价非挥发性化学品和低挥发性化学品对大黄蜂的急性经口毒性。 本文件不适用于高挥发性的化学品。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T21845 化学品水溶解度试验 GB/T21855 化学品与pH有关的水解作用试验 GB/T22052 用液体蒸气压力计测定液体的蒸气压力温度关系和初始分解温度的方法 GB/T22228 工业用化学品固体及液体的蒸气压在10-1Pa至105Pa范围内的测定静态法 GB/T22229 工业用化学品固体及液体的蒸气压在10-3Pa至1Pa范围内的测定蒸气压平
衡法
OECD化学品测试导则No.104蒸气压（VapourPressure）
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
急性经口毒性 acute oral toxicity 在最长96h的试验期内，受试物单次经口暴露产生的不良效应。
3.2
剂量dose 受试物的消耗量或使用量。 注：以每蜂摄入受试物的质量表示，即μg/蜂。
3.3
半数致死剂量 median lethaldose LDso 单次经口暴露导致50%的受试动物死亡的受试物剂量。 注：经过统计计算得出，以μg/蜂表示。
3.4
无明显作用剂量 noobservedeffectdose;NOED 未观察到作用剂量无可观察效应剂量与对照组相比，死亡率无统计学显著性差异的剂量。
1 GB/T 41622—2022
4受试物信息
在试验前，应掌握受试物的下列信息： "a）纯度； b) 按照GB/T21845方法测定的水中溶解度； c) 受试物在水溶液中的定量分析方法 d) 按照GB/T21855方法测定的水解作用； e) 按照GB/T22052、GB/T22228、GB/T22229或OECD化学品测试导则No.104方法测定的
蒸气压和亨利常数。 测定上述参数的温度应在试验报告中予以说明。
5参比物
按不小于预期死亡率50%的剂量，用参比物进行试验，验证受试蜂的敏感性和该试验系统的可靠性。宜选农药乐果作参比物。急性经口暴露条件下，乐果有效成分（a.i.)剂量为4ug/蜂时，受试蜂死亡率不小于50%。也可使用能使受试蜂表现出预期敏感性的其他有毒参比物。
6试验原理
将成年工蜂暴露于含有受试物的500g/L蔗糖水溶液。试验持续时间至少48h。在对照组死亡率不大于10%时，若至少一个试验组在24h～48h之间死亡率增加不小于10%，应将试验延长至96h。 每天记录死亡率并与对照组结果进行比较。对结果进行分析，计算24h和48h的LDso和NOED值，以及在试验延长后的72h和96h的LDsc和NOED值。
7试验准备
7.1受试蜂
7.1.1采用成年的大黄蜂(Bombusspp.)工蜂。
注：可选红光熊蜂（Bombusignitus）、明亮熊蜂（Bombuslucorum）、小峰熊蜂（Bombushypocrita）等。 7.1.2收集中等规模，包括各个发育阶段的幼虫和一只产卵期的蜂王、60只～80只工蜂的大黄蜂蜂群用于试验。自蜂群到达实验室之日起一周内使用蜂群进行试验。
7.2试验笼具
7.2.1每只大黄蜂在一个独立的笼中单独喂养，防止（没有蜂王的工蜂之间)互相攻击引起死亡，并可准确评价受试蜂受到的影响。 7.2.2使用易于清洁或一次性的、通风良好的笼具。可采用不锈钢、纸板、金属丝网、塑料、木材等合适的材料制造的笼具。试验笼具的大小应与受试蜂的体型相适应（最小为15cm"）。更多信息见附录A。 7.3大黄蜂采集和随机分组 7.3.1在转移到试验笼之前，在红光下（不麻醉)或通过急速冷冻，从蜂群采集成年大黄蜂工蜂。只使用那些在未去除棉层（如果存在)的蜂群中采集的成年大黄蜂工蜂（详情见附录A）。通过目视检查，去除体型非常小和特别大的工蜂。幼蜂（可通过灰色的软毛辨识）、雄蜂和蜂王不能用于试验。
2 GB/T41622—2022
7.3.2试验中，对每只受试蜂单独称重，然后随机放人不同试验组。 7.4处理和饲喂
可在红色光或灯光下进行包括试验处理和观察在内的试验操作。将蔗糖溶于水中制备最终浓度为 500g/L的饲喂溶液（例如500g/L的蔗糖水溶液），使用适当的饲喂器（饲喂器可采用剪掉尖端的市售容积2mL的塑料注射器），饲喂所有受试蜂。在暴露阶段，受试蜂喂食含有受试物或参比物的饲喂溶液。在观察期间，所有受试蜂均自由进食未加受试物的500g/L蔗糖水溶液。 7.5受试蜂的准备 7.5.1受试蜂应在试验条件下（包括单笼饲养）至少驯养8h，自由饮用未加受试物的500g/L的蔗糖水溶液。在试验开始前一且发现濒死的大黄蜂，应及时丢弃并用健康的大黄蜂代替。因此，笼具和驯养工蜂的数量应超过试验所需受试蜂的数量。宜多准备5%的受试蜂和笼具。应额外考虑对非摄食蜂的补偿，见8.3.5。 7.5.2为确保受试蜂在4h内摄入含有受试物的饲喂溶液，受试蜂在暴露前禁食2h～4h。 7.6试验溶液准备 7.6.1将受试物贮备液或受试物与500g/L的蔗糖水溶液混合。对水溶性好的受试物，用水溶解。对水溶性差的受试物，可用有机溶剂（如丙酮)溶解。根据受试物溶解性选择溶剂的浓度，并将受试物处理组和溶剂对照组按相同方式处理。如果用丙酮作溶剂，最终饲喂溶液中丙酮的浓度应尽量低，且最大浓度不应超过5%（体积分数）。只要符合溶剂对照组的有效性要求，也可使用任何其他溶剂、增溶剂或增稠剂（例如，改善饲喂溶液的均匀度）。 7.6.2通过稀释贮备液或高浓度溶液来准备最终饲喂溶液，即500g/L的蔗糖水溶液。 7.6.3如果使用溶剂、增溶剂、分散剂等来溶解受试物，应制备适当的溶剂对照组溶液。在这种情况下，应使用两个独立的对照组：一个是500g/L蔗糖水溶液的空白对照组，另一个是含有溶剂、增溶剂、 分散剂等的溶剂对照组，浓度与受试物处理组相同。 7.7受试物分析验证 7.7.1试验期间，饲喂溶液添加受试物后，至少取出一份最低浓度和一份最高浓度的受试物溶液，直接放在一18℃以下冷冻保存，用于分析受试物实际浓度。如果使用贮备溶液制备饲喂溶液，额外取一份用于准备饲喂溶液的贮备液冷冻保存，用于分析。 7.7.2如果试验期间使用不同批次的受试物，应从每一批次受试物的溶液中分别取出一份最低浓度和一份最高浓度的受试物溶液，分析每批次受试物实际浓度。宜使用同一批次受试物进行试验。
8试验程序
8.1设置试验组和对照组 8.1.1应先进行预试验，确定正式试验的浓度范围，以选择适当的剂量值。试验浓度以及平行试验个数的设置应满足LD5o及其95%置信限计算的统计学要求。通常按等比设置5个试验浓度，等比系数不大于2.2，涵盖LDs的剂量范围。应依据“浓度-死亡数”毒性曲线斜率设置试验浓度及个数，并考虑结果分析时所选用的统计学方法。 8.1.2每个浓度的受试物处理组至少设30个平行（笼），每个平行（笼）中1只受试蜂。对于毒性较低的受试物，可用50个平行（笼)的空白对照组和受试物处理组、至少30个平行（笼）的毒性参比物对照组进行限度试验。
3 GB/T41622—2022
8.1.3一个蜂群的受试蜂数量不够进行一个剂量-反应试验，需要来自多个(至少三个)蜂群的工蜂。应将来自不同蜂群的受试蜂随机分在各个处理组，避免一个处理组内的任何蜂群效应。 8.2使用溶剂时的对照组
如果试验中使用溶剂，应设置2个对照组：水空白对照组和溶剂对照组。检验水空白对照组和溶剂对照组的统计学显著性差异。如果没有显著性差异，可将这两个对照组一并进行进一步的统计学评价。 如果存在统计学的差异，溶剂对照组结果用于计算LDso和校正受试物处理组的死亡率。 8.3暴露（饲喂） 8.3.1为每只受试蜂提供40μL含有适当剂量受试物的500g/L蔗糖水溶液。如果有足够证据证明合适，也可用其他体积。为准确测定摄食量，在饲喂前后对灌装了添加受试物的饲喂溶液的饲喂器进行称重。饲喂开始时，将装有添加受试物饲喂溶液的饲喂器插人试验笼中；饲喂结束时，将这些饲喂器更换为装有不含受试物的500g/L蔗糖水溶液的饲喂器。暴露时间不应超过4h。然后提供未处理的 500g/L蔗糖水溶液供受试蜂自由饮用。 8.3.2对于某些化学品，在较高剂量下，受试蜂拒食受试物可能导致摄食量很少甚至没有。最长4h 后，应用无受试物的500g/L蔗糖水溶液替代未食用的含受试物的饲喂溶液。 8.3.3试验中可能出现所谓的“非摄食蜂”。这些受试蜂未进食蔗糖溶液，未暴露于受试物。即使在对照组中，在相同条件下，“非摄食蜂”的摄食量也明显低于其他受试蜂。“非摄食蜂”是在最大暴露（饲喂）期内，消耗量小于各处理组平均消耗量的80%的特殊受试蜂。由于摄食量有限，“非摄食蜂”尚未充分暴露于受试物，因此不应在终点计算中考虑。否则，“非摄食蜂”的有限暴露可能导致高估LDso值。如果剔除不相关的低摄食数据点，应在10.2试验报告中说明。 8.3.4如需要，试验结束后，将受试蜂分为摄食和非摄食两类，在原始数据和最终报告中提供二者全部数据记录。非摄食蜂的数据应在数据记录中进行标记，并在终点计算时排除这些数据。特殊情况下（例如，观察到受试物的拒食作用），如果合理，可将摄食阈值较低的个体纳入分析。 8.3.5为了弥补每个受试物处理组中的非摄食蜂缺失的数据点，每组宜使用超过30只受试蜂，并使用摄食蜂替换非摄食蜂。
注：驯养期间死亡的大黄蜂需要额外补充。 8.4试验条件
试验过程中，受试蜂应放在避光、稳定、可控的人工气候条件下，温度25℃士2℃，相对湿度 (60士20)%。试验过程中还应采用合适的且经过校准的设备持续记录这些试验条件。短期（2h以内）偏离此范围（如由于启动操作）在一定程度上是不可避免的，一般不会对试验造成较大于扰，
8.5试验时间
受试蜂对受试物暴露后，至少观察48h。在对照组的死亡率保持在不大于10%的可接受水平时，若至少一个受试物处理组24h～48h之间死亡率增加大于10%，则应延长试验时间，最长至96h。 8.6观察和测量 8.6.1在试验开始后4h～5h记录死亡率，并在24h、48h分别记录死亡率。如果延长观察时间，应在 72h和96h后进行进一步评估。 8.6.2在评估死亡率的同时，每天记录亚致死效应。亚致死效应如下记录：
a）未受影响的：受试蜂未表现出异常行为（包括自然的静止状态）； b）有影响的：受试蜂仍然能站立、行走，但协调性明显降低； 4 GB/T41622—2022
c）濒死的：受试蜂不能走，且只有腿和触角很微弱的活动，对外来刺激（如光照或吹风）只有微弱
的反应；这样的受试蜂大多死亡，只有少数能恢复。
8.7限度试验
8.7.1在预计受试物毒性较低的情况下，可进行限度试验（如有效成分剂量采用100μg/蜂），以确定 LDso是否大于该剂量值。试验程序如8.1～8.6所述（包括相关的空白对照组和毒性参比物对照组的使用），但除毒性参比物对照组至少采用30个平行外，每个受试物处理组采用50个平行来代替30个平行。 8.7.2限度试验中，若受试蜂的死亡具有统计学显著性，应进行完整剂量-反应试验。如果观察到亚致死效应，应按8.6所述方法记录。
9质量保证与质量控制
在试验结束时如果同时满足以下条件，试验结果有效： a) 只有500g/L蔗糖水溶液的空白对照组受试蜂的死亡率不大于10%；溶剂对照组（如有）受试
蜂的死亡率不大于10%； b) 毒性参比物对照组受试蜂的死亡率不小于50%。
10数据与报告
10.1数据处理
应以表格形式总结数据，显示每个试验组（包括所有对照组、毒性参比物对照组和受试物处理组）使用的受试蜂数量、每个观察时间点的死亡率和表现出亚致死效应的受试蜂数量。采用适当的统计学方法（例如概率分析法、Weibull函数、二项式概率、拟合剂量-反应模型)分析受试蜂的死亡率数据。绘出每一观察时间点（即24h、48h，以及72h、96h)的剂量反应曲线图，计算曲线斜率及其95%置信限的半数致死剂量(LDso）。可使用标准程序（如Abbott校正法）校正对照组死亡率。试验终点(LDso）以单只受试蜂实际消耗受试物的量来表示（μg/蜂）。 10.2 试验报告
试验报告应包括以下内容。 a) 受试物和参比物：
单一组分的物质：物理状态、水溶解性及相关的物理化学性质；化学标识，如IUPAC名称
·
或CAS名称、CAS号、SMILES码或InChI码、通用名、结构式、纯度、杂质的化学鉴别（如适用且实际可行）等信息（如有机碳含量，如适用）；多组分的物质、UVCBs（成分未知或组分多变、复杂反应产物或生物材料）和混合物：通过
·
化学鉴别获得尽量多的各组分特性信息、相关理化特性；来源、批次和/或批号（如有）；
·
受试物在水或溶剂中的溶解度（如有）； ·物理状态和相关理化性质； ·化学鉴别标识，如化学名、IUPAC号或CAS号。
O
b）试验系统：
· 受试蜂学名、种类、来源、以周为单位的近似蜂龄（如有）、采集方法、采集日期、每只体重及
健康状况；
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