ICS 13.060.30; 71. 100. 40 CCS G 77
HG
中华人民共和国化工行业标准
HG/T 5926—2021
水处理用生物药剂
反硝化菌剂
Biological agents for water treatmentDenitrifying microbial agents
2022-04-01实施
2021-12-02发布
中华人民共和国工业和信息化部发布 HG/T 5926—2021
前言
本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中国石油和化学工业联合会提出。 本文件由全国化学标准化技术委员会水处理剂分技术委员会（SAC/TC63/SC5）归口。 本文件起草单位：黄河三角洲京博化工研究院有限公司、神美科技有限公司、中海油天津化工研
究设计院有限公司、深圳市长隆科技有限公司、四川水王子环境科技有限公司、海南尚泽环保科技有限公司、重庆蓝洁生物技术有限公司、普罗生物技术（上海）有限公司、武汉水之国环保科技有限公司、碧沃丰生物科技（广东）股份有限公司、重庆大学、大连宇都环境工程技术有限公司、深圳市深水水务咨询有限公司、浙江绿野净水剂科技股份有限公司、天津正达科技有限责任公司。
本文件主要起草人：杨传伦、石伟杰、王妍、董红红、余京儒、尚国利、魏小兵、袁磊、吴定心、范德朋、郑怀礼、陈晓会、孟庆杰、邵宏谦、俞明华、张全。
(13)
I HG/T5926—2021
水处理用生物药剂
反硝化菌剂
1范围
本文件规定了水处理用生物药剂反硝化菌剂产品的要求、试验方法、检验规则、标志、包装、运输和贮存以及安全要求。
本文件适用于水处理用生物药剂反硝化菌剂产品。 注：该产品主要用于废污水的生化处理和生态修复。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文
件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T191一2008包装储运图示标志 GB/T603化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备 GB/T6682一2008分析实验室用水规格和试验方法 GB/T7480水质硝酸盐氮的测定酚二磺酸分光光度法 GB/T7493水质 亚硝酸盐氮的测定分光光度法 GB/T8170一2008数值修约规则与极限数值的表示和判定 GB20287—2006农用微生物菌剂 HJ/T415环保用微生物菌剂环境安全评价导则
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3. 1
反硝化菌剂 Jdenitrifyingmicrobial agents 在缺氧条件下，以有机碳源作为电子供体，将污水中的硝态氮或亚硝态氮还原为氮气，从而实现
污水脱氮的无安全风险的异养微生物菌剂。
3. 2
菌剂活化activationofmicrobialagents 将保藏状态的菌种放人适宜的培养基中培养，使其恢复活性，获得活力旺盛的培养物的过程。
4要求
4.1外观：液体产品为无色、淡黄色或棕褐色液体；固体产品为类白色、淡黄色或棕褐色粉末或颗粒。
(15)
1 HG/T 5926—2021
4.2 2反硝化菌剂的技术指标应符合表1的要求，
表 1 单位 CFU/mL CFU/g %
指 标
项 目
指标方向
液体 1.0×10°
固体
-
菌量水分含量 pH值杂菌率 (以霉菌计)
> ≤
3.0X109 18. 0 5.0~8.5
6.5~8.5
-
%
≤ >
10 一 12
mg NO;-N/(L· h) mg NO; -N/(g · h) mg NOz-N/(L · h) mg NO, -N/(g · h)
150
硝态氮还原性能
反硝化性能
50
亚硝态氮还原性能
4
-
5试验方法
5.1通则
本文件所用的试剂和水，在没有注明其他要求时，均指分析纯试剂和GB/T6682一2008中规定的三级水。
试验中所需制剂及制品，在没有注明其他要求时，均按GB/T603的规定制备。 5.2外观检验
在自然光下，于白色衬底的表面皿或白瓷板上用目视法判定外观。 5.3菌量的测定 5.3.1原理
每个活菌在适宜的培养基和良好的生长条件下可以通过生长形成菌落，培养基内部及表面生长的每一个菌落来源于样品稀释液中的一个活菌。将反硝化菌在一定条件下培养后，通过测定每克或每毫升样品中的具有反硝化能力的微生物菌落总数计算菌量。 5.3.2试剂或材料 5.3.2.1甲液：称取0.5g对氨基苯磺酸，溶解于150mL10%乙酸溶液中。 5.3.2.2乙液：称取0.1g甲萘胺，加入20mL水，溶解于150mL10%乙酸溶液中。 5.3.2.3二苯胺试剂：向20mL水中加入100mL硫酸，混匀。称取0.5g二苯胺，溶解于该溶液中。 5.3.3仪器设备 5.3.3.1 高压蒸汽灭菌锅：温度能够控制在121℃士1℃。
(16)
2 HG/T5926—2021
5.3.3.2恒温培养箱。 5.3.3.3旋转式摇床。 5.3.4 试验步骤
5.3.4.1：无菌水的制备
将水装人三角瓶中，用组培封口膜封口，于121℃士1℃下高压蒸汽灭菌30min，冷却，备用。 5.3.4.2培养基的制备 5.3.4.2.1培养基I
培养基中各物质浓度：胰蛋白陈10.0g/L；酵母提取物5.0g/L；氯化钠10.0g/L；琼脂15g/L~ 20 g/L。
用碳酸钠溶液或盐酸溶液调节pH值为6.5～7.0，于121℃士1℃下高压蒸汽灭菌30min。 5.3.4.2.2培养基Ⅱ
培养基中各物质浓度：蛋白陈20g/L；牛肉膏3g/L，氯化钠5g/L；硝酸钾1g/L。 用碳酸钠溶液或盐酸溶液调节pH值为7.4士0.2，分装于试管中，于121℃士1℃下高压蒸汽灭
菌30min。 5.3.4.3样品稀释
称取1g固体样品（精确至0.2mg）或移取1.00mL液体样品，加至带玻璃珠的99mL无菌生理盐水中，在旋转式摇床上以200r/min充分振荡30min，即成10-2菌悬液。用移液枪吸取 1.00mL菌悬液，加至装有9mL无菌水的试管中，充分混匀，即成10-3菌悬液。以此类推，连续稀释，制成10-4、10-5、10-6等一系列稀释度菌悬液，供平板涂布使用。（每个稀释梯度应换无菌枪头）。 5.3.4.4涂布及培养
将20mL～30mL灭菌后冷却至50℃左右的培养基I倾注于平皿中。待培养基凝固后，每个样品选取3个适宜的稀释度，每个稀释度移取0.10mL加至预先制备好的固体平板培养基上，用涂布棒涂布均匀，每个稀释度平行涂布3个。同时以无菌水作为空白对照。
将平板倒置于35℃土1℃的恒温培养箱中，培养12h～24h。 5.3.4.5菌落计数
以出现30个～300个菌落数的稀释度的平板为计数标准。 若只有1个稀释度，其平均菌落数在30个～300个之间时，以该平均菌落数计算。 若有2个稀释度，其平均菌落数均在30个～300个之间时，应按两者菌落总数的比值决定。若
比值小于等于2，应计算两者的平均数；若比值大于2，则以稀释度小的菌落平均数计算。 5.3.4.6确证试验
反硝化菌应具有硝酸盐还原活性，从有效计数平板中随机选出5个～10个菌落进行确证试验。 将待测菌落接种到培养基Ⅱ上，于36℃±1℃下培养2d～4d。加入甲液和乙液各1滴，观察结
果。如溶液变为红色、橙色，即为硝酸盐还原阳性。如无红色出现，取0.1mL至洁净的白色点滴板
(17)
3 HG/T 5926—2021
上，滴加1滴2滴二苯胺试剂，如不呈蓝色则为硝酸盐还原阳性，如呈蓝色则为硝酸盐还原阴性。 5.3.5结果计算
菌量以每毫升或每克样品中的菌落数X计，液体产品数值以菌落形成单位每毫升（CFU/mL）表示，固体产品数值以菌落形成单位每克（CFU/g）表示，按公式（1）计算：
NN2f X= N,V
(1)
式中： N- 菌落平均数； N2 硝酸盐还原确证为阳性的菌落数；
-稀释度；
-
N1—用于确证试验挑选的菌落数； V-—涂布的稀释菌液的体积的数值，单位为毫升（mL）（V=0.1）。
5.4水分含量的测定
5.4.1方法提要
在一定温度下，将样品置于电热干燥箱内烘干至恒量，根据干燥前后的样品质量差值测得水分含量。 5.4.2仪器设备 5.4.2.1电热干燥箱：温度可控制在110℃士2℃。 5.4.2.2称量瓶：d60mm×30mm。 5.4.3试验步骤
使用预先于110℃土2℃下干燥至恒量的称量瓶称取约1g样品（精确至0.2mg），置于干燥箱中，在110℃士2℃下干燥2h，取出后置于干燥器中冷却至室温，称量，直至恒量。 5.4.4结果计算
水分含量以质量分数w1计，数值以%表示，按公式（2）计算：
m-(mi-m。)
(2)
X100
W,
m
式中： m 试料的质量的数值，单位为克（g）； mi 干燥后样品和称量瓶的质量的数值，单位为克（g）； mo 称量瓶的质量的数值，单位为克（g）。 计算结果表示到小数点后2位。
5.4.5允许差
取平行测定结果的算术平均值为测定结果。两次平行测定结果的绝对差值不大于0.05%。
(18)
4 ICS 13.060.30; 71. 100. 40 CCS G 77
HG
中华人民共和国化工行业标准
HG/T 5926—2021
水处理用生物药剂
反硝化菌剂
Biological agents for water treatmentDenitrifying microbial agents
2022-04-01实施
2021-12-02发布
中华人民共和国工业和信息化部发布 HG/T 5926—2021
前言
本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中国石油和化学工业联合会提出。 本文件由全国化学标准化技术委员会水处理剂分技术委员会（SAC/TC63/SC5）归口。 本文件起草单位：黄河三角洲京博化工研究院有限公司、神美科技有限公司、中海油天津化工研
究设计院有限公司、深圳市长隆科技有限公司、四川水王子环境科技有限公司、海南尚泽环保科技有限公司、重庆蓝洁生物技术有限公司、普罗生物技术（上海）有限公司、武汉水之国环保科技有限公司、碧沃丰生物科技（广东）股份有限公司、重庆大学、大连宇都环境工程技术有限公司、深圳市深水水务咨询有限公司、浙江绿野净水剂科技股份有限公司、天津正达科技有限责任公司。
本文件主要起草人：杨传伦、石伟杰、王妍、董红红、余京儒、尚国利、魏小兵、袁磊、吴定心、范德朋、郑怀礼、陈晓会、孟庆杰、邵宏谦、俞明华、张全。
(13)
I HG/T5926—2021
水处理用生物药剂
反硝化菌剂
1范围
本文件规定了水处理用生物药剂反硝化菌剂产品的要求、试验方法、检验规则、标志、包装、运输和贮存以及安全要求。
本文件适用于水处理用生物药剂反硝化菌剂产品。 注：该产品主要用于废污水的生化处理和生态修复。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文
件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T191一2008包装储运图示标志 GB/T603化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备 GB/T6682一2008分析实验室用水规格和试验方法 GB/T7480水质硝酸盐氮的测定酚二磺酸分光光度法 GB/T7493水质 亚硝酸盐氮的测定分光光度法 GB/T8170一2008数值修约规则与极限数值的表示和判定 GB20287—2006农用微生物菌剂 HJ/T415环保用微生物菌剂环境安全评价导则
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3. 1
反硝化菌剂 Jdenitrifyingmicrobial agents 在缺氧条件下，以有机碳源作为电子供体，将污水中的硝态氮或亚硝态氮还原为氮气，从而实现
污水脱氮的无安全风险的异养微生物菌剂。
3. 2
菌剂活化activationofmicrobialagents 将保藏状态的菌种放人适宜的培养基中培养，使其恢复活性，获得活力旺盛的培养物的过程。
4要求
4.1外观：液体产品为无色、淡黄色或棕褐色液体；固体产品为类白色、淡黄色或棕褐色粉末或颗粒。
(15)
1 HG/T 5926—2021
4.2 2反硝化菌剂的技术指标应符合表1的要求，
表 1 单位 CFU/mL CFU/g %
指 标
项 目
指标方向
液体 1.0×10°
固体
-
菌量水分含量 pH值杂菌率 (以霉菌计)
> ≤
3.0X109 18. 0 5.0~8.5
6.5~8.5
-
%
≤ >
10 一 12
mg NO;-N/(L· h) mg NO; -N/(g · h) mg NOz-N/(L · h) mg NO, -N/(g · h)
150
硝态氮还原性能
反硝化性能
50
亚硝态氮还原性能
4
-
5试验方法
5.1通则
本文件所用的试剂和水，在没有注明其他要求时，均指分析纯试剂和GB/T6682一2008中规定的三级水。
试验中所需制剂及制品，在没有注明其他要求时，均按GB/T603的规定制备。 5.2外观检验
在自然光下，于白色衬底的表面皿或白瓷板上用目视法判定外观。 5.3菌量的测定 5.3.1原理
每个活菌在适宜的培养基和良好的生长条件下可以通过生长形成菌落，培养基内部及表面生长的每一个菌落来源于样品稀释液中的一个活菌。将反硝化菌在一定条件下培养后，通过测定每克或每毫升样品中的具有反硝化能力的微生物菌落总数计算菌量。 5.3.2试剂或材料 5.3.2.1甲液：称取0.5g对氨基苯磺酸，溶解于150mL10%乙酸溶液中。 5.3.2.2乙液：称取0.1g甲萘胺，加入20mL水，溶解于150mL10%乙酸溶液中。 5.3.2.3二苯胺试剂：向20mL水中加入100mL硫酸，混匀。称取0.5g二苯胺，溶解于该溶液中。 5.3.3仪器设备 5.3.3.1 高压蒸汽灭菌锅：温度能够控制在121℃士1℃。
(16)
2 HG/T5926—2021
5.3.3.2恒温培养箱。 5.3.3.3旋转式摇床。 5.3.4 试验步骤
5.3.4.1：无菌水的制备
将水装人三角瓶中，用组培封口膜封口，于121℃士1℃下高压蒸汽灭菌30min，冷却，备用。 5.3.4.2培养基的制备 5.3.4.2.1培养基I
培养基中各物质浓度：胰蛋白陈10.0g/L；酵母提取物5.0g/L；氯化钠10.0g/L；琼脂15g/L~ 20 g/L。
用碳酸钠溶液或盐酸溶液调节pH值为6.5～7.0，于121℃士1℃下高压蒸汽灭菌30min。 5.3.4.2.2培养基Ⅱ
培养基中各物质浓度：蛋白陈20g/L；牛肉膏3g/L，氯化钠5g/L；硝酸钾1g/L。 用碳酸钠溶液或盐酸溶液调节pH值为7.4士0.2，分装于试管中，于121℃士1℃下高压蒸汽灭
菌30min。 5.3.4.3样品稀释
称取1g固体样品（精确至0.2mg）或移取1.00mL液体样品，加至带玻璃珠的99mL无菌生理盐水中，在旋转式摇床上以200r/min充分振荡30min，即成10-2菌悬液。用移液枪吸取 1.00mL菌悬液，加至装有9mL无菌水的试管中，充分混匀，即成10-3菌悬液。以此类推，连续稀释，制成10-4、10-5、10-6等一系列稀释度菌悬液，供平板涂布使用。（每个稀释梯度应换无菌枪头）。 5.3.4.4涂布及培养
将20mL～30mL灭菌后冷却至50℃左右的培养基I倾注于平皿中。待培养基凝固后，每个样品选取3个适宜的稀释度，每个稀释度移取0.10mL加至预先制备好的固体平板培养基上，用涂布棒涂布均匀，每个稀释度平行涂布3个。同时以无菌水作为空白对照。
将平板倒置于35℃土1℃的恒温培养箱中，培养12h～24h。 5.3.4.5菌落计数
以出现30个～300个菌落数的稀释度的平板为计数标准。 若只有1个稀释度，其平均菌落数在30个～300个之间时，以该平均菌落数计算。 若有2个稀释度，其平均菌落数均在30个～300个之间时，应按两者菌落总数的比值决定。若
比值小于等于2，应计算两者的平均数；若比值大于2，则以稀释度小的菌落平均数计算。 5.3.4.6确证试验
反硝化菌应具有硝酸盐还原活性，从有效计数平板中随机选出5个～10个菌落进行确证试验。 将待测菌落接种到培养基Ⅱ上，于36℃±1℃下培养2d～4d。加入甲液和乙液各1滴，观察结
果。如溶液变为红色、橙色，即为硝酸盐还原阳性。如无红色出现，取0.1mL至洁净的白色点滴板
(17)
3 HG/T 5926—2021
上，滴加1滴2滴二苯胺试剂，如不呈蓝色则为硝酸盐还原阳性，如呈蓝色则为硝酸盐还原阴性。 5.3.5结果计算
菌量以每毫升或每克样品中的菌落数X计，液体产品数值以菌落形成单位每毫升（CFU/mL）表示，固体产品数值以菌落形成单位每克（CFU/g）表示，按公式（1）计算：
NN2f X= N,V
(1)
式中： N- 菌落平均数； N2 硝酸盐还原确证为阳性的菌落数；
-稀释度；
-
N1—用于确证试验挑选的菌落数； V-—涂布的稀释菌液的体积的数值，单位为毫升（mL）（V=0.1）。
5.4水分含量的测定
5.4.1方法提要
在一定温度下，将样品置于电热干燥箱内烘干至恒量，根据干燥前后的样品质量差值测得水分含量。 5.4.2仪器设备 5.4.2.1电热干燥箱：温度可控制在110℃士2℃。 5.4.2.2称量瓶：d60mm×30mm。 5.4.3试验步骤
使用预先于110℃土2℃下干燥至恒量的称量瓶称取约1g样品（精确至0.2mg），置于干燥箱中，在110℃士2℃下干燥2h，取出后置于干燥器中冷却至室温，称量，直至恒量。 5.4.4结果计算
水分含量以质量分数w1计，数值以%表示，按公式（2）计算：
m-(mi-m。)
(2)
X100
W,
m
式中： m 试料的质量的数值，单位为克（g）； mi 干燥后样品和称量瓶的质量的数值，单位为克（g）； mo 称量瓶的质量的数值，单位为克（g）。 计算结果表示到小数点后2位。
5.4.5允许差
取平行测定结果的算术平均值为测定结果。两次平行测定结果的绝对差值不大于0.05%。
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