ICS 67.050 CCS X 04
CIS
中国仪器仪表学会标准
T/CIS67002—2021
3种剧毒鹅膏菌的物种鉴别 PCR 扩增-Sanger 测序法
Species identification of three lethal amanitasPCR amplification-
Sanger sequencing
2021-11-01发布
2022-01-01实施
中国仪器仪表学会 发布 本标准由中国仪器仪表学会制定，其著作权为中国仪器仪表学会所有。除
了用于法律许可范围或事先得到中国仪器仪表学会文字上的许可外，不许以任何形式再复制本标准。如果关于本标准有任何著作权/版权或相关咨询，请联系中国仪器仪表学会或本标准出版社！
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目 次
前言引言
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范围 2 规范性引用文件
术语和定义缩略语原理试剂及配制仪器和设备鉴别分析步骤 8.1 采样 8.2 试样制备 8.3 DNA提取 8.4 PCR扩增 8.5 PCR产物电泳检测 8.6 PCR产物纯化及胶回收 8.7 克隆纯化 8.8 测序 8.9 序列分析结果判断与表述 9.1 结果判断 9.2 结果表述 10 检测过程中防止交叉污染的措施· 11 危害性废弃物处理· 附录A（资料性） PCR产物纯化及胶回收示例附录B（资料性） 克隆纯化示例附录C（资料性） 参考序列
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前言
本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中国仪器仪表学会提出并归口。 本文件起草单位：国家食品安全风险评估中心、湖南师范大学、江西省疾病预防控制中心、浙江省疾
病预防控制中心、辽宁省疾病预防控制中心。
本文件主要起草人：李楠、陈作红、江涛、王佳慧、何正蜜、张眉眉、刘洋、陈鸿、耿英芝
II T/CIS 67002—2021
引言
采用PCR扩增-Sanger测序法鉴别致命鹅膏等3种剧毒鹅膏菌，以鹅膏菌基因组DNA为模板，针对ITS1-5.8SrDNA-ITS2区域进行PCR扩增、克隆和测序，通过与参考序列比对进而对物种进行鉴别。其优点在于突破了形态学鉴定的局限性，不受样品个体形态特征、发育阶段的影响和限制，从DNA 水平为引发食物中毒或相关研究的鹅膏菌的物种鉴别提供依据，
本文件的制定目的是为致命鹅膏等3种剧毒鹅膏菌的物种鉴别提供统一的操作程序，使其鉴别实现标准化，从而显著提升蘑菇中毒事件的检测、鉴别和防控能力。
V T/CIS67002—2021
3种剧毒鹅膏菌的物种鉴别 PCR扩增-Sanger测序法
1范围
本文件给出了3种剧毒鹅膏菌物种鉴别的PCR扩增-Sanger测序法。 本文件适用于致命鹅膏（Amanitaeritialis）、灰花纹鹅膏（Amanitafuliginea）和裂皮鹅膏
（Amanitarimosa）的物种鉴别。
2规范性引用文件
2
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T6682一2008分析试验用水规格和试验方法 GB/T19495.2一2004转基因产品检测实验室技术要求 GB/T27403一2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测 GB/T35918—2018 3动物制品中动物源性检测基因条码技术Sanger测序法
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
鹅膏菌 amanita 隶属于真菌界、担子菌门、担子菌纲、伞菌目、鹅膏菌科、鹅膏属的真菌。
3.2
Sanger测序法 Sanger sequencing 双脱氧链终止法以单链或双链DNA为模板，在DNA聚合酶的催化下延伸结合在模板上的引物，直到掺入一种链
终止核苷酸为止。每个反应含有四种dNTP，并混人用同位素或荧光标记的ddNTP，使延长的寡聚核苷酸选择性终止，通过高分辨率变性毛细管电泳分离片段获得碱基顺序的方法
［来源：GB/T35918—2018,3.1.2]
3.3
可疑蘑菇样品 suspiciousmushroomsamples 在蘑菇中毒事件中，中毒者食用剩余的磨菇样品，或流行病学调查中采集到的经中毒者确认其所进
食的磨菇样品。 3.4
呕吐物样品 vomitsamples 中毒者呕吐的胃内容物。
1 T/CIS67002—2021
4缩略语
下列缩略语适用于本文件。 BLAST：碱基局部对准检索工具（basiclocalalignmentsearchtool) BOLD：生命条形码数据系统（barcodeoflifedatasystem） CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrithylammoniumbromide） DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid) ITS：内转录间隔区（internaltranscribedspacer） NCBI：美国国家生物技术信息中心（NationalCenterforBiotechnologyInformation） PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction） Tris：三羟甲基氨基甲烷（tris（hydroxymethyl)methylaminomethane)）
5原理
根据rDNA（真菌核糖体DNA)基因上种间多态性的差异，采用PCR扩增-Sanger测序法，对致命鹅膏等3种剧毒鹅膏菌进行物种鉴别。即：利用裂解液破碎细胞，三氯甲烷抽提蛋白质，异丙醇沉淀得到DNA；采用ITS通用引物对提取DNA的ITS1-5.8SrDAN-ITS2区域进行PCR扩增，扩增产物克隆并测序后与参考序列比对，确定物种名称。
6 试剂及配制
除非另有说明，本文件中的鉴别分析过程仅使用分析纯试剂和重蒸馏水或符合GB/T6682一2008 规定的二级水。 6.1通用引物序列：
正义引物ITS5:5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3 反义引物ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3°
6.2 TaqDNA聚合酶。 6.3 三氯甲烷（CHCl：）。 6.4 异戊醇（C,H12O）。 6.5 异丙醇(CHsO)。 6.6 乙醇(CHO)。 6.7 氯化钠（NaCI)。 6.8 盐酸(HCI)。 6.9 冰乙酸（CH;COOH)。 6.10 氢氧化钠（NaOH）。 6.11 乙二胺四乙酸（EDTA）。 6.12 乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）。 6.13 琼脂糖（C24H38O1g）。 6.14 溴化乙锭（EB)。 6.15 溴酚蓝（CiH1oBrOsS)。 6.16 甘油（CHO）。 6.17 二甲苯腈蓝FF（C2sH2zN2NaOS2）。
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