ICS 13.300 CCS A 80
GB
中华人民共和国国家标准
GB/T41691—2022
化学品 蜜蜂幼虫单次暴露毒性试验
Chemicals-Honey bee larval single exposure toxicity test
2022-10-12发布
2022-10-12实施
国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会
可
发布 GB/T 41691—2022
前言
本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由全国危险化学品管理标准化技术委员会（SAC/TC251)提出并归口。 本文件起草单位：生态环境部固体废物与化学品管理技术中心、浙江省农业科学院、上海化工研究
院有限公司、生态环境部南京环境科学研究所、厦门尹巢科技有限公司、上海市检测中心、上海市环境科学研究院、贵州省分析测试研究院、浙江省化工研究院有限公司、广东全庆检测有限公司。
本文件主要起草人：刘纯新、王波、周荃、舒耀皋、廖朝选、王彦华、刘新洋、窦从从、郭敏、刘敏、沈根祥、 林鹏翔。
一 GB/T 41691—2022
引言
本文件描述了在实验室条件下进行的蜜蜂幼虫急性毒性试验方法，以经济合作与发展组织
(OECD)化学品测试导则No.237《蜜蜂幼虫毒性试验，单次暴露》为依据。No.237的方法以一种法国开发的比较成熟的方法为基础，从2005年到2008年已在欧洲7个实验室进行了环比试验。
本方法涉及美国、加拿大和欧洲各国的试验要求，在第1层级测试策略的实验室条件下，投喂加标饲料来测试化学品对蜜蜂幼虫的毒性。
本方法的目的是通过蜜蜂幼虫对某一化学品（特别是农药的有效成分或制剂)进行单次暴露，测得 72h半致死剂量（72h-LDso）。所得数据用于蜜蜂种群风险评估。本方法是对“蜜蜂急性经口毒性试验”(GB/T21812)和“蜜蜂急性接触性毒性试验”(GB/T21813)成蜂试验方法的补充。在整个蜜蜂的风险评估流程中，本方法属于较低层级的试验方法
I GB/T41691—2022
化学品 品蜜蜂幼虫单次暴露毒性试验
警示一一使用本文件的人员应有正规实验室工作的实际经验。本文件并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。
1范围
本文件规定了化学品蜜蜂幼虫单次暴露毒性试验的受试物信息、试验原理、参比物质、试验准备、试
验程序、质量保证与质量控制、数据与报告。
本文件适用于测试易溶于水、不易挥发的化学品对蜜蜂幼虫单次暴露的毒性。 本文件不适用于易挥发的化学品。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T21812 化学品 蜜蜂急性经口毒性试验 GB/T 21813 化学品 蜜蜂急性接触性毒性试验 GB/T 21845 化学品水溶解度试验 GB/T21852 化学品 分配系数（正辛醇-水）高效液相色谱法试验 GB/T21853 化学品 分配系数（正辛醇-水）摇瓶法试验 GB/T21855 化学品 与pH有关的水解作用试验 GB/T22052 用液体蒸气压力计测定液体的蒸气压力温度关系和初始分解温度的方法 GB/T22228 工业用化学品 固体及液体的蒸气压在10-1Pa至105Pa范围内的测定 静态法 GB/T22229 工业用化学品 固体及液体的蒸气压在10-3Pa至1Pa范围内的测定蒸气压平
衡法
OECD化学品测试导则No.104 蒸气压（VapourPressure） OECD化学品测试导则No.112 2水中解离常数（DissociationConstantsinWater）
3术语和定义
GB/T21812和GB/T21813界定的术语和定义适用于本文件。
4受试物信息
受试物的以下信息有助于试验设计： a）按照GB/T21845方法测定的水中溶解度； b）有机溶剂中的溶解性： c）按照GB/T22052、GB/T22228、GB/T22229或OECD化学品测试导则No.104方法测定的
- GB/T41691—2022
蒸气压和亨利常数； d) 受试物结构式； e) 受试物纯度； f) 按照OECD化学品测试导则No.112方法测定的解离常数pK。值； g) 按照GB/T21855方法测定的水解作用； h）光解； i) 按照GB/T21852或GB/T21853方法测定的正辛醇-水分配系数； j) 受试物的物理性质及来源（批次、批号）。
5试验原理
在试验第一天（D1），从三个繁殖蜂巢中取出第一龄期（L1)蜜蜂幼虫（即同为一目龄的幼虫），分别
放人48孔细胞培养板，在板孔中人工标准化饲养。在试验第四天（D4)，将受试物按5个递增浓度与饲料混合，按单次剂量投喂蜜蜂幼虫。记录试验第五天（D5）、第六关（D6)和第七关（D7)的死亡量。计算幼虫72h的LD5（D7的累积死亡量）
参比物质
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首选乐果原药（CAS号60-51-5）为参比物质，用来验证试验系统和试验条件的可靠性。按含有活
性物质（有效成分)的剂量（8.8μg士0.5μg)/幼虫，将参比物质溶解于最多3μL水中，在处理幼虫前，与常规饲料混合，在试验第四天（D4)投喂给蜜蜂幼虫。
7试验准备
7.1 试验装置及准备
幼虫应在透明的聚苯乙烯育王台基中饲养，其内径为9mm，深度为8mm。育王台基在试验开始时进行杀菌，如可用酒精或其他杀菌溶液浸泡30min，取出后在通风橱中晾干。将育王台基每个格放置于48孔细胞培养板的一个小孔中。宜将一片牙科棉吸入加有150g/L甘油的杀菌液500μL，放人孔的底部，使育王台基的顶部与培养板保持水平（见图1)。
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4
标引序号说明： 1——幼虫+饲料； 2 —育王台基； 3- 一培养孔； 4— 一浸透杀菌液的牙科棉。
图1培养孔中的幼虫单元格
2 GB/T41691—2022
将这些培养板放入密封的有机玻璃干燥器。为保持干燥器中空气水分饱和，其中放一个盛有硫酸
钾（K，SO，)饱和溶液的培养皿。将干燥器置于一个配有强制空气循环系统的培养箱中，试验期间，培养箱温度保持在34℃～35℃。 7.2供试生物及准备 7.2.1供试生物
采用意大利蜜蜂（Apismellifera）幼虫为供试生物。
7.2.2幼虫的来源
从3个不同蜂巢的蜂群中收集幼虫，每个蜂巢的蜂群作为一个平行组（见8.1）。蜂群应喂食充足、 健康，无疾病和寄生虫。应了解它们的生活史和生理状态。
在蜂王产卵繁殖期进行试验。如果对蜂巢进行卫生处理（如除螨或抗病处理)，应报告处理的日期及所用药物的信息。在试验开始前四周内进行卫生处理的蜂巢，其蜂群不应用于试验。
在试验前四天（D-3)，为确保幼虫分别来自3个不同的蜂群，采取用一个隔离的笼子罩住一个空的蜂脾的方式，将3只蜂王限制在各自的蜂巢中（见图2）。将隔离的笼子紧着有蜂群的蜂脾。在试验前三天(D-2)，检查有新蜂卵产出后，将蜂王从笼中移出（见图3)。蜂王隔离不应超过30h。宜减少隔离蜂王的时间，以便将同一蜂脾中幼虫在体型大小和虫龄之间的差异降至最低。将装有蜂卵的蜂脾留在笼中，孵化阶段一直放在蜂群边，直到孵化出幼虫（D1)。
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2
3
标引序号说明： 1——含有幼虫的蜂脾； 2——隔离笼； 3——正在孵化的蜂脾。
图2 2一个带隔离笼蜂房的横截面
3 GB/T41691—2022
饲料种类饲喂量
B C+受试物 c 20 μL 30 μL 40 μL 50 μL
c
A 20 μL
T D6
A DO
T D2
1 D-1
1 D3
I D4
1 D5
D-2
D-3
D1
D7
产卵期
孵卵期
幼虫期
下午：移出蜂王
试验结束
移取1日龄幼虫
早上：将蜂王隔离
实验室内：温度34~35℃；相对湿度95%
蜂巢内
图3蜜蜂幼虫毒性试验主要步骤示意图
7.3饲养材料的准备 7.3.1幼虫饲料
根据幼虫不同发育阶段的需要，按下列组分配比准备日常饲料： a）饲料A(D1)：用含2%（质量分数)酵母膏、12%（质量分数）葡萄糖和12%（质量分数)果糖的水
溶液与鲜蜂王浆按质量比1：1配制； b）饲料B(D3)：用含3%（质量分数)酵母膏、15%（质量分数)葡萄糖和15%（质量分数)果糖的水
溶液与鲜蜂王浆按质量比1：1配制； c) 饲料C(从D4到D6）：用含4%（质量分数)酵母膏、18%（质量分数）葡萄糖和18%（质量分数）
果糖的水溶液与鲜蜂王浆按质量比1：1配制。 如果一些结晶残留于糖水中，应完全溶解后，再与蜂王浆混合。“鲜蜂王浆”指前12个月内从蜂巢
内收集到并冷冻保存的蜂王浆；为避免每次试验都对整个批次的鲜蜂王浆进行解冻，可将鲜蜂王浆分成 5g一份，在小于或等于一10℃下保存。如果可证明市售蜂王浆的性能与实验室的历史数据一致，例如幼虫期的死亡率不超过15%，可采用市售的蜂王浆。宜对每批蜂王浆进行污染物的多残留分析，验证其未受污染（主要是杀菌剂和杀虫剂）。
整个试验期间，在每次试验开始前配制好新鲜饲料并放置在小于或等于5℃的冰箱中储存（不能结冰）。也可将它们提前配制好并深度冷冻保存。 7.3.2试验溶液
通常用反渗透水溶解受试物。对于难溶的受试物，可使用溶剂（宜采用丙酮）助溶来制备贮备液。 在这种情况下，应在常规的空白对照组以外增加一个溶剂对照组。如果用有机溶剂，用量要尽可能低；如果用丙酮，用量不应超过第四天（D4)最终饲料投喂量的5%。
4 GB/T 41691—2022
宜使用反渗透水或溶剂（如果是难溶化合物)将贮备液稀释成五个不同浓度的受试物溶液，宜在对幼虫处理之前，使用带有过滤头的一次性吸管进行稀释。如果用水溶解受试物，伺料中受试物溶液的量不应超过最终投喂饲料量的10%（例如，D4投喂量为30L，最多只能加入3L受试物溶液），如果用内酮溶解，不应超过5%（例如，D4投喂量为30μL，最多只能加人1.5L受试物溶液）。
为了分析测定受试物的浓度，贮备液样品应在小于或等于一10℃条件下冷冻保存。
8试验程序
8.1暴露的条件
培养板单独的一个小格放人一只幼虫作为一个试验单元。从三个蜂巢的每个蜂巢中最少取12只幼虫，按每个受试物浓度、空白对照组以及参比物程序对照组的顺序放在同一培养板上。每次试验用到的对照组和受试物处理组有：
一空白对照组（无溶剂)（每个蜂巢最少12只幼虫、最少3个蜂巢，即最少36只幼虫）；一溶剂对照组，如有（每个蜂巢最少12只幼虫、最少3个蜂巢，即最少36只幼虫）；一一五个受试物处理组，即5个等比递增浓度组（每个浓度每个蜂巢最少12只幼虫、最少3个蜂
巢，即36只幼虫），浓度公比不超过3，浓度范围覆盖LDso；或进行限度试验（见8.3），取有效成分（或受试物)100μg/幼虫或可达到的最大溶解浓度，选择较低者，作为单一剂量；
一一参比物程序对照组，乐果暴露剂量为8.8μg/幼虫（每个蜂巢最少12只幼虫、最少3个蜂巢，即
最少36只幼虫）。 每次试验总共需48孔培养板7个～8个（如果用溶剂）。每组从三个蜂巢中分别取最少12只幼
虫，作为给定受试物处理浓度的一个平行组，并在这些微孔培养板上予以确认。
试验过程中，所有培养板应在黑暗的条件下、34℃～35℃的培养箱中进行试验。温度可出现一定的偏差，但不应低于23℃或高于40℃，且每24h内出现的偏差不应超过一次，持续时间不应超过 15 min。 8.2预试验
为估计LD5o的范围，宜进行预试验。预试验中受试物剂量按几何级数递增的间隔系数在5～10 之间。 8.3限度试验
在某些情况下（例如预计某种受试物的毒性可能很低，或某种化学品难溶于水），为了证明LD50比某限度值更大，可按有效成分（或受试物）限度剂量100μg/幼虫，进行限度试验。对于达不到此剂量的难溶化学品，按最大实际溶解浓度进行限度试验。将来自3个不同蜂巢的最少12只幼虫分为3个重复组来进行限度剂量试验，相应的空白对照组及参比物程序对照组也需同样数量的幼虫。如果与空白对照组相比，死亡率具有统计学上的显著性差异，应重新开展完整的试验。 8.4幼虫的收集
在第一天(D1)，将带有一龄幼虫的蜂脾从蜂巢中取出，在避免温度波动的前提下，放在一个隔离容器中转移到实验室，随后保存在室温条件下（不低于20℃）。在通风橱或其他洁净条件下将幼虫移人已投加饲料A的育王台基。为了避免由幼虫之间个体差异所产生的偏差，宜收集新孵化的幼虫，即还没有变为“C”字形的幼虫。每个蜂巢对应某几块培养板，将装有幼虫的育王台基随机放人对应培养板的孔中。一共3组平行，从三个蜂巢中分别最少取12只幼虫，在第四天（D4)对其进行受试物暴露；因此，
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