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固定动物组织冰冻切片技术的探讨
金云涛1郭莹莹2韩勇权2崔成都2
（1、吉林省白城市森林公，吉林白城1370002、廷边大学农学院，吉林延吉133002）
科技论坛
摘要：为改造固定组织冰涨切片过程中出现的冰晶现象及脱片现象，本试验以据尔马林固定的猪肺脏为材料，进行次冻切片并对其进行HE染色，通过对载玻片进行防脱片处理，以及将组织没泡于蔗糖溶液中降低冰晶产生，从而提升冰冻切片的质量。结果表明，经燕糖没泡过的组织，切片完整、厚薄均匀、不易形成缺析；镜下组织结构完整，细胞形态清晰，染色鲜艳，胞质与胞核红蓝对比鲜明，细胞无肿胀且无明显收缩，组织无人为裂隙，无空泡及空网状形成，而未经落糖没泡过的组织，切片不完整，组织中有许多空隙，厚薄不一，镜下组织结构不完整；多聚赖氨酸处理过的载玻片的脱片数为零，在四个试剂中防脱片效果最佳，其次是明胶硫酸铬钾，而经蛋白甘油处理过的载玻片和从试制公司购买的载玻片出现不同程度的脱片现象。
关键词：冰冻切片；切片技术；冰晶过多；脱片
冰冻切片是将生物组织置于低温下迅速冻结达到一定硬度后进行切片的一种实验技术，与常规的石蜡切片相比，它不经脱水、透明、浸蜡等步骤，因此组织不会收缩，易保持原有生活形态，具有快速、简便、易操作等优点常用于组织化学、免疫定位及原位杂交等研究。由此可知，冰冻切片具有制作迅速，耗时短的优点，但是固定组织在制片过程中经常出现组织脱片，组织肿胀或过度收缩，冰晶形成过多等间题。这些间题将导致实验信息的丢失，使最终得出的结果不准确。因固此，本试验以福尔马林固定的者肺为试验材料进行冰冻切片，通过对载玻片进行防脱片处理，以及将材料浸泡于蕾糖容液中降低冰晶的产生等方法，探索固定组织冰冻切片的有效方法，为临床病理学诊断提供试验依据。
1材料和方法
1.1试验材料。用中性福尔马林固定猪肺，由延边大学农学院动物医学系病理实验室提供。
1.2方法。12.1载玻片的处理。将新购未经处理的载玻片经1%盐酸夜泡24h，流水冲洗，再经洗涤剂没泡24h，流水冲洗，烘干，分别经蛋白甘油、多聚赖氨酸、明胶硫酸铬钾处理，122组织的处理。将取好的组织，分为两组，第一组流水冲洗24h。第二组流水冲洗24h，再浸泡在20%蔗糖 24h，30%蔗糖3天。1.23切片（1)包埋：从冰冻机中取出包埋托，用水冲洗略去掉表面冰霜，用干纱布擦干，滴加03em厚包埋剂，然后将取材的组织放在包埋剂上。对于含水分较多的组织先用纱布吸干组织表面水分再进行包理。包埋后在组织周围进一步补充包理埋剂，尽量将组织包在其中用。（2)时间及温度：将包埋好的组织放人冰冻机的冷冻台上冷冻。根据不
同组织将温度控制在-18℃
30℃。严格控制冷冻时间，以刚网冻上
即止为宜。（3)切片及贴片：组织冻好后，进行切片、贴片。切片厚度一般为 10μm，脂肪组织可稍厚些借助载玻片与冰冻。冰冻切片与载玻片存在明显温差，利用这一原理可将二者牢固的贴附在一起。12.4切片的HE 染色方法。苏木精染色液是关键的药品，要严格进行配置配制方法：先把 2g苏木精和20ml无水乙醇互溶，然后将40g硫酸铝钾溶于400ml蒸馏水需加热溶解并用玻璃棒不断搅拌，再将以上这两种液体混合后煮大约 1min待违腾，离火后向该混合液快速加人1g氧化汞，并用玻璃精搅拌至染色液变为紫红色，然后需冷却至室温，加人16ml冰醋酸并混匀，滤过后使用。乙醇盐酸配制成1%浓度的分化液方法：1ml浓盐酸，99ml75% 乙醇。02%要水配制方法：25%28%数水02ml蒸幅水100ml，HE染色程序：蒸馅水（2min）→苏本精（5min）→水洗（20min）→1%盐酸乙醇分（2s） →蒸馏水(1min）02%氨水返蓝（30s±）→蒸馏水(1min）→伊红（4min） →蒸馏水(1min)→70%乙醇(1min)→80%乙醇(1min)90%(1min）→ 95%乙醇(1min）→无水乙醇（1min）无水乙醇：二甲苯1:1(1min）→二甲苯I(5min）二甲苯I(10min）用树胶封片，进行镜下观察。
2结果
2.1防冰晶作用。经蕾糖漫泡过的组织，切片完整、厚薄均匀、不易形成皱折：镜下组织结构完紧，细胞形态清断，染色鲜艳，胞质与胞核红蓝对比鲜明，细胞无肿胀且无明显收缩，组织无人为裂隙，无空泡及空网状形成，而未经能糖没泡过的组织，切片不完整，组织中有许多空隙，厚薄不一，镜下组织结构不完整
2.2防脱片作用。如表1所示，多聚颗酸的脱片数为零，在四个试剂中防脱片效果最佳。其次是明胶硫酸铬钾，脱片数为二，防脱片效果也很优秀。而经蛋白甘油处理过的载玻片和从试剂公司购买的载玻片脱片
通讯作者：准成都。
现象严重。
表1不同附贴方法对切片脱片效果
组刻蛋白甘油组多策赖氨酸组明胶疏酸落钾组试制公司的实部
3讨论
总片数 8
显片激
未酸片数 B即相6
冰冻切片是较难掌握的病理技术之一，要制作出一张高质量的冰冻切片，冰冻制片每一步都应严格要求，减少冰冻切片的人工误差，才能更好地应用于临床。据研究学者作切片之前将组织慢泡于蓝糖溶液和对载玻片进行防脱片处理可以极大地提升冰冻切片的质量。将组织置于恒冷箱切片机后，组织中的水分子就会逐渐避固，最终产生冰晶，而冰晶的体积大于水分子，因此会占据更多空间，使得周围细胞器的空间被压缩，当操作员将冰冻切片从划片机中移到室温环境时，由于温度的升高，冰晶文融化回水分子，体积减小造成组织上空原的形成，使组织碎片化，产重影
响后续的步骤。
4C时体积达到最大值这意味着组织在-4左右
的低温度中放置时间越久组织内所产生的冰晶的体积越大、数量越多，即组织冷冻的速度与组织内形成冰晶的数量成反比。因固此要尽量避免冷却速度缓慢的情况应使组织所处环境的温度迅速降至-4以下：或者将组织进行脱水处理来减少冰晶的形成。OCT胶是最佳切片温度溶液是一种
多糖类物质
支架起到包理作用又可以对组织进行脱水，但它
的脱水效果远不及蓄糖溶波明显四本试验结果表明，蕾糖处理，可有效提
高切片的质
悉浮但尚未脱下
脱片是指组织从载玻片上脱落，分离或
载玻片的处理及工作人员对切片制作的熟练度等都随能
影响冰冻切片的脱片情况，固定组织冰冻切片很易脱片，给后续染色等过程带来了很大麻烦与不便，这些因固素会使冰冻切片在染色过程中脱片程度不一，切片可能是边缘部轻度卷曲，也可能是不同面积的脱落或完全脱片。如何处理载玻片是防脱片的关键步骤，据报道防脱片剂有多种类型，如蛋白甘油，多聚粮氨酸，明胶硫酸铬钾。其中多聚赖氢酸溶波配制方便，该多聚阳离子分子与组织切片上的明离子相互作用产生较强的粘附力，粘附效果显著。可用于组织切片，细胞切片，冰冻切片等.能切实有效的降低脱片现象。本试验结果表明，多聚赖氢酸的脱片数为零，在四个试剂中防脱片效果最佳。其次是明胶硫酸铬钾，脱片数为二，防脱片效果也很优秀。而经蛋白甘油处理过的载玻片和从试剂公司购实的载玻片脱片现象严重。息之冰冻切片不易掌握要做好一张冰冻切片不能只注重速度其他方面也很重要。为了不误诊，漏诊确保结果的准确迅速需要工作人员在进行冰冻切片时有严格的责任心，密切联系临床，严谨的工作态度，丰富的工作实践经验不断总结自已过往的经验，从而不断的提升自己的技术水平。
参考文献
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