· 42 ·
科技论坛
芦苇床中芦苇内生菌群总DNA提取方法研究
王毅李亚琪孙婷宇张天歌
（大连民族大学环境与资源学院，辽宁大连116600）
摘要：本文对污泥千化芦第床中芦第内生菌总DNA的提取方法造行了研究，实验经过模索后采用Soil DNAKit提取基组DNA 对不同来源的芦第内生群总DNA进行提取。利用PCR技术对不同来源的总DNA的提取方法进行了对比分析。以期应用分子生物学技术研究和评价芦第共生尊群改变，从而为改善芦第床工艺设计提供生物学证据。
关键词：污泥干化芦第床；共生菌群；总DNA提取；RCR
污泥干化芦茅床是一种相对较新的污泥稳定化技术，近年来
的2ml离心管。k.加人等体积的xP1Buffer。涡旋混匀。1将柱子
得到广泛的研究和应用，该技术是周期性地布泥于人工湿地表面，固体物质被截留，并在植物、微生物和阳光等自然力作用下，逐渐获得稳定。在污泥稳定过程中，微生物起到重要作用4。芦茅共生菌群的研究有利于为稳定芦第床污泥，改良土壤、增加土壤肥力以及沙
地绿化提供理论依据，同时也为人工湿地中共生菌防治病虫害的菌株研究提供更广泛的生物学基础。
1材料和方法 1.1实验样品
天然湿地污泥样品和天然湿地地芦苇样品取于辽宁省大连开发区炮台山公园，污泥样品和芦苇床芦茅样品取于污泥干化芦茅床对比试验场。污泥于化芦董床对比试验场位于辽宁省大连开发区新润恒基水务公司.有效面积为3.0mx3.0m，平均分为1、2、3个单元(3.0m×1.0m)。其中，1、2单元设立通气管，2.3单元裁种芦茅，各单元独立运行。床体内充填填料高度为65em，由下至上依次为炉渣
组装在2ml离心管上，将步骤k的混合液转移到柱子上。m。室温 10000xg离心1min，弃滤液。n，加300μ1XP1Buffer到柱子上， 10000xg 离心1min，弃滤液。o.加人 700μ1 SPWWash Buffer， 10000xg离心1min，弃滤液。p.重复步骤o，13000xg室温离心2min。
9把柱子转移到新的1.5ml离心管中，将30-100μ165预热的 Elution Buffer加人到柱子基质中，室温放置在23 min。r.13000xg 室温离心1min洗脱DNA，重复q-r步。s.把制得存于1.5ml离心管的样品放置于-20℃冰箱或4℃保存备用。提取的总产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测。
1.3.2 PCR 检测
a.PCR反应体系：使用20μ1反应体系，模板DNA0.5μ1、引物 27F(5pmol/μ1)2ul 引物) 1492R(5pmol/μ1)2ul,2 x buffer 10ul,无菌水5.5ul补齐至20μ1。
h.PCR反应条件：预变性94℃5min;扩增程序94℃30s，45℃
30s，72℃1min，40个循环；然后72℃补充延伸7min，4℃保存。扩
20cem、酬石20em、英砂滤料科25cm，其中表层3cm和细沙，超高部分为65cm，其作用是为污泥积存提供足够的空间。进泥由配泥管完
增产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测。
成，排水管位于各单元底部。试验运行采用间流进泥，七天为一个周期.每周期第一天进泥司。
1.2实验设计
2结论
本文使用Sigma公司生产的Soil DNAKit对芦苇共生菌总 DNA的提取方法进行研究，利用16SrDNA的PCR方法对污泥干
实验共设7组微生物DNA提取及分析，分为3组不同取样点
化床中污泥的微生物以及芦共生菌与天然湿地中污泥与芦茅共
芦根茎微生物DNA及4组不同取样点污泥DNA提取及分析。
第一组：天然湿地污泥样晶：第二组：天然湿地地芦蒂样晶：第三组：1号污泥干化床污泥样晶；第四组：2号污泥干化芦苇床污泥样品；第五组：2号污泥干化芦苇床芦蒂样品；第六组：3号污泥干化芦蒂床污泥样品；第七组：3号污泥干化芦蒂床芦苇样品。
1.3测定方法
1.3.1微生物基固组DNA提取与纯化
每个样品取0.3g污泥样品或0.2g芦革根系样品提取DNA，本实验经过摸索P-后采用Sigma公司生产的Soil DNAKit提取基因组DNA。参照试剂盒说明书具体操作如下：a当日取样，封存于密封袋中。在实验室中依次通过采用70%乙醇清洗1分钟，次氯酸钠溶波渡（2%的可利用氯）清洗3分钟，70%乙醇清洗30秒进行消毒并用无菌蒸馏水进行二次漂洗。然后用剪刀截取芦根茎10克左右置于烧杯中，剪碎(赖粒直径约为0.2mm)备用。b.用药匙称500mg玻璃珠分别加人7个2ml离心管中，依次接实验设计分组加入各样品及1mlBuffer SLX-Mlus，最高速度涡旋3-5min。e.加入100ul BufferDS涡旋混匀，70℃水浴10mind.6000rpm室温离心5min，转移800μ1上清液至2ml离心管，加270μ1BufferP2,涡旋混匀。e.冰浴5min，4℃13000xg离心5min，小心转移上清液到一新的2ml 离心管，加人0.7体积的异丙醇，反复颠倒20-30次，若样本含有 DNA较少，把混合液在-20℃中孵育1h。f.4℃13000xg离心10 min，沉淀DNA。g小心去除上清液，注意别倒出DNA，可以用离心机稍离心用移波枪吸出上清液舍弃。h.加200ulElutionBuffer,涡旋 10s,70°C孵育 1020min,溶解 DNA。i.加 50100ul HTR Reagent,涡旋10s混匀(使用前先把HTRReagent摇匀，吸取前枪头剪大一些)，放置在室温孵育两分钟。j.13000xg高心2min，转移上清液到新
生菌的总DNA进行了比较分析，明确了总DNA的提取方法。以期应用分子生物学技术研究和评价芦茅共生菌群改变，从而为改善芦蒂床工艺设计提供生物学证据
参考文献
[I]CUI Y B, SUN H J, YANG M L, et al. Plant growth for sewage sludge ecological stabilization [J]. Joumal of Residuals Seienoe & Technology, 2012, 9(1): 4753.
[2]CUI Y B, WU X H, LIU ZH SH, et al. Ecological stabilization of thickened wastewater sludge from CAST process[JJ.Water Science and Technology, 2008, 58(10):19111916
[31准金香,王帅,任岩岩等.土境微生物多样性研究进展河南农业科学，2010.6(6):165169
[4]杨欢,韦华瑜,孙路等.一种新型的污泥稳定技术——污泥干化芦第床J).科技视界，2014,11(11):137
[5]高伟.污泥干化芦茅床处理割余污泥及其运行效能研究[D]哈尔滨工程大学，2013
[6]王世全，补永暂，准玉波，周建康，古洋，顾晚欣.基于pmoA基因的污泥千化芦第床中甲烷氧化首多样性分析[]安全与环境学报， 2015(5): 235238.
[7]李惠敏，胡雪英，泰新民.一种适用于PCR的土填微生物DNA的提取方法[]安徽微农业科学,2010，38(2):600-601.
[8]吕新，陈丽华，李玥仁.4种不同土境微生物DNA提取方法对 DGGE分新微生物群落的影响J].据建农业学报,2012,27(4):367-372[9]徐爱玲,吴等等,宋志文等.引物选择对污泥微生物多样性分析的影响J].环境科学，2013,9(9):36203626
注：本文受2015年度大连民族大学大学生创新创业训计划项日资助（指导教师：张万筠，准玉波）。