SN ICS 65.020.20 CCS B 16
中华人民共和国出入境检验疫行业标准
SN/T 5546—2022
欧洲樱桃绕实蝇检疫鉴定方法Detection and identification of Rhagoletis cerasi(Linnaeus)
2022-07-07发布
2023-02-01实施
中华人民共和国海关总署发布
SN/T 5546—2022
欧洲樱桃绕实蝇检疫鉴定方法
1 范围
本文件规定了欧洲樱桃绕实蝇 Rhagoletis cerasi（Linnaeus，1758）的检疫鉴定方法。本文件适用于植物及植物产品中欧洲樱桃绕实蝇的检疫和鉴定。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
SN/T1883 苹果实蝇检疫鉴定方法SN/T1847 寡毛实蝇类害虫分类学术语
3 术语和定义
SN/T1383和SN/T1847界定的术语和定义适用于本文件。
4 欧洲樱桃绕实蝇基本信息
学名：Rhagoletis cerasi（Linnaeus，1758）。
异名：Musca cerasi（Linnaeus，1758），Rhagoletisfasciata（Rohdendorf，1961），Rhagoletis nig-ripes(Rohdendorf,1961),Rhagoletis obsoleta(Hering,1936),Tephritis ceraci(Persson,1958), Trypeta signata(Meigen,1826),Urophora cerasorum(Dufour,1845),Urophora liturata(Robineau-Desvoidy,1830)。
英文名：European cherry fruit fly，cherry fruit fly，cherry maggot。其他中文名称：欧洲樱桃实蝇，樱桃绕实蝇。
分类地位：双翅目Diptera，实蝇科Tephritidae，绕实蝇属Rhagoletis。
传播途径：成虫具有一定的飞行能力，可进行近距离传播。成虫、幼虫、卵随寄主果实和运输工具远距离传播，老熟幼虫、蛹可随土壤、介质等进行远距离传播。
欧洲樱桃绕实蝇的其他信息参见附录A。
5 方法原理
根据欧洲樱桃绕实蝇的为害状，在检疫现场发现疑似欧洲樱桃绕实蝇为害的果实，获取卵、幼虫、蛹或成虫等样本，卵、幼虫或蛹须饲养至成虫后制作成针插标本，置于体视显微镜下观察，依据成虫的形态特征对种类进行鉴定。也可利用欧洲樱桃绕实蝇特异性扩增引物的常规PCR检测方法和实时荧光PCR检测方法，对欧洲樱桃绕实蝇进行种类判定。
6 器材和试剂
6.1 器材
可封口塑料袋、标签、培养皿、吸水纸、镊子、小毛笔、指形管、纱布、冰箱、三角纸、剪刀、昆虫针、滴管、培养皿、载玻片、盖玻片、体视显微镜、荧光定量PCR仪、PCR仪、冷冻混合球磨仪、超净工作台、电泳仪、凝胶成像分析仪、核酸蛋白检测仪、微量组织捣碎仪、高速冷冻离心机、研磨机、台式小型离心机、制冰机、旋涡震荡器、移液器、电子天平、pH计、水浴锅、生物培养箱、纯水仪、高压灭菌器、超低温冰箱等。6.2 试剂
醋酸钾、双蒸馏水、液氮、蛋白酶K（20mg/mL）、RNA消化酶、Tris饱和酚、Premix Ex Tay（2×）、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、75%乙醇、95%乙醇、100%乙醇、10×PCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）、Tag 酶、DNA Marker、琼脂糖、Gold View 型核酸染色剂（5 000×）、引物探针、昆虫基因组DNA 提取试剂盒、白砂糖、啤酒酵母、苯酚、氢氧化钠（钾）等。
提取液A：1%SDS，50mmol/LTris·Cl（pH8.0），25 mmol/L NaCl，25 mmol/LEDTA（pH8.0）。
7 现场检疫
仔细检查果实表面有无产卵痕迹，或果实是否有腐软的现象，剖果检查是否有组状幼虫。将染虫果或者怀疑带虫的果实进行培养观察。欧洲樱桃绕实蝇为害状参见附录B。
8 实验室鉴定
8.1 形态学鉴定8.1.1 饲养
8.1.1.1 卵或幼虫的饲养
将现场采取的卵或幼虫部分个体制成鉴定标本，其余个体继续用原寄主果实培养。具体的培养方法是：将带有卵或幼虫的寄主果实放在小号白瓷盘里，然后将小号白瓷盘放在装有自来水的大号白瓷盘内，再用防虫网罩住小号白瓷盘，罩的下方边缘浸没于大号白瓷盆内的水中。置于温度为20℃～25℃，湿度为30%～60%的生物培养箱中饲养至幼虫老熟。8.1.1.2 蛹的饲养
取一盛有洁净细砂的养虫杯（沙子厚度10 cm，含水量5%～10%），将现场检疫收集的或室内培养得到的围蛹埋于距细砂表而3cm～5cm处（若是老熟幼虫则可直接将其置于细砂表面，幼虫将钴入沙中化蛹）。将养虫杯放置于5℃以下的冰箱中冷藏180d左右，取出养虫杯置于温度为22℃～25℃，湿度为30%～60%的生物培养箱中饲养，直至成虫羽化。8.1.1.3 成虫的饲养
成虫羽化后，悬挂相应寄主果实切片于养虫箱内供其取食；或将白砂糖和啤酒酵母按照1：2质量比混合制成饲料放入小容器中喂养，此外，在培养皿中放入几张滤纸，加适量的水浸透滤纸供成虫饮用。