SC/T 7220-2015
中华绒螯蟹螺原体PCR检测方法
PCR detection method of Spiroplasma eriocheiris
2015-02-09发布
2015-05-01实施
前 言
本标准按照 GB/T 1.1—2009 给出的规则起草。
本标准由农业部渔业渔政管理局提出。
本标准由全国水产标准化技术委员会（SAC/TC 156）归口。
1 范围
本标准规定了对中华绒螯蟹螺原体病原分离、纯化以及 PCR 检测的方法。
本标准适用于中华绒整蟹等水生甲壳动物（包括中华绒鳌蟹 Eriocheir sinensis、凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei、克氏原整虾 Procambarus clarki、罗氏沼虾 Macrobrachium rosenbergii，下文均是以中华绒螯蟹为对象）中华绒整蟹螺原体感染的流行病学调查、检疫和监测。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件∶仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
SC/T 7103 水生动物产地检疫采样技术规范
SC/T 7202.2-2007 斑节对虾杆状病毒（MBV）病诊断规程 第2部分∶PCR 检测方法
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
中华绒螯蟹螺原体 spiroplasma eriocheiris
具有体积小（可以滤过0.22um 孔径滤膜）、会运动、有螺旋结构、没有细胞壁、可以用人工培养基培养等特征。该病原侵染中华绒螯蟹血淋巴细胞后在其内大量繁殖形成包涵体;该病原还广泛侵染中华绒螯蟹机体内所有器官（包括鳃、心脏、肝胰腺、肌肉、神经、消化道等）的结缔组织。螺原体侵染神经时，可以引起宿主附肢颤抖，最终导致被感染宿主死亡。
4 试剂和材料
4.1 Chelex-100悬浊液（5%）!称取5.0g Chelex-100混于100 mL 去离子水中，常温保存。
4.2 酒精;100%，分析纯。
4.3 蛋白酶K∶20mg/mL。
4.4 DIL.2000 DNA分子量标准。
4.5 溴化乙锭（EB）;10mg/mL。
4.6 琼脂糖∶电泳级。
4.7 dNTP;10 mmol/L，含dATP、dTTP、dCTP、dGTP各 10 mmol/L的混合物，-20℃保存。
4.8 Taq DNA聚合酶∶5 U/μL，—20℃保存。
4.9 10×PCR缓冲液∶-20℃保存。
4.10 5×TBE电泳缓冲液。
4.11 6×上样缓冲液。
4.12 引物 F1;∶5'-GATCAATCAATTGGTTTA-3'，R1∶5'-GGTTAGTTCTCTCAGATAGTA-AGAA-3'用无菌去离子水配制成 10 μmol/L，一20℃保存，用以扩增中华绒整蟹螺原体16srRNA-23s rRNA间区序列。
4.13 0.0l mol/L磷酸盐缓冲液PBS。