ICS._07.080
B 30
C
中华人民共和国国家标准
GB/T 30988-—2014
多酚类植物基因组DNA提取纯化
及测试方法
Methods of genomic DNA extraction from plants with high levels of polyphenols
2015-03-01实施
2014-07-24发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局
中国国家标准化管理委员会 发布 GB/T30988—2014
目 次
前言
1
范围 2 规范性引用文件 3 缩略语
原理 5 实验室通用要求试剂与溶液
4
6
仪器和设备提取步骤
8
9 DNA纯度、浓度测试 GB/T 30988—2014
前 言
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由中国测试技术研究院提出。 本标准由全国生化检测标准化技术委员会（SAC/TC387）归口。 本标准起草单位：中国测试技术研究院、中测测试科技有限公司。 本标准主要起草人：谭和平、沈兴中、唐祥凯、周李华、孙登峰。
E GB/T30988—2014
多酚类植物基因组DNA提取纯化
及测试方法
1范围
本标准规定了以茶树为代表的多酚类植物基因组DNA提取纯化方法以及DNA纯度、浓度测试
方法。
本标准适用于茶树、马铃薯、楼桃、葡萄以及其他富含多酚类的植物的植物基因组DNA提取及纯化。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682一2008分析实验室用水规格和实验方法 GB/T19495.3--2004转基因产品检测核酸提取纯化方法
3缩略语
下列缩略语适用于本文件。 Tris：三(羟甲基)氨基甲烷 SDS：十二烷基磺酸钠 PVP：聚乙烯吡咯烷酮 RNaseA：核糖核酸酶A FF：二甲苯青 EDTA：乙二胺四乙酸 TE：三（羟甲基）氨基甲烷-乙二胺四乙酸
4原理
4.1提取纯化
在液氮条件中，通过物理研磨方法破碎多酚类植物叶片的细胞，利用抗氧化剂防止多酚类化合物氧化褐变，同时利用聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的粘接性去除多酚类化合物及其他次生代谢物等杂质，然后利用化学方法使DNA从植物细胞中释放出来，再弃除DNA中的蛋白质等杂质，以及DNA提取过程中加入的异戊醇、异丙醇、乙醇等有机溶剂，最后得到纯的DNA， 4.2纯度测试
在pH7～8.5下，根据DNA在260nm处有吸收高峰，蛋白质在280nm处有吸收高蜂，硫氰酸盐、 碳水化合物（糖类）在230nm处有吸收高蜂，酚类物质在270nm处有吸收高峰的特性，利用A260/A280、
1 GB/T30988-2014 A260/A230、A260/A270的比值来评估DNA样品的纯度。然后利用A260=1相当于50μg/mL的双链 DNA来计算DNA的浓度。
利用荧光染料（如漠化乙啶)可与琼脂糖凝胶中的DNA嵌合，在紫外源激发下发出荧光的特性，通过观察DNA条带是否单一、清晰、明亮来评估DNA样品的纯度。
5实验室通用要求
按照GB/T19495.32004第4章中实验室通用要求的规定执行。
6试剂与溶液
6.1本标准所使用的水均为一级水，符合GB/T6682一2008的要求。除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂，所有试剂溶液宜大体积配制、小体积分装后经高压灭菌后使用，不宜高压灭菌的试剂应用 0.22um膜过滤除菌；酶溶液应避免反复冻融。 6.2葡萄糖（glucose，CgH12O）。 6.3焦亚硫酸钠（sodiumpyrosulfite，NazS,Os）。 6.4聚乙烯吡咯烷酮polyvinylpyrrolidone，PVP，(CH.NO)，」。 6.5β-巯基乙醇(β-mercaptoethanol,HOCH,CHzSH)。 6.6 十二烷基磺酸钠（sodiumdodecylsulfate，SDS,Ci2H2sO,SN)。 6.7 乙二胺四乙酸二钠（ethylenediaminetetraaceticaciddisodiumsalt，NazEDTA，CH4N2ONaz）。 6.8 三（羟甲基）氨基甲烷[tris（hydroxymethyl）methylaminomethane，Tris，C,HnNO：」。 6.9无水乙醇（alcohol,CzHsOH)，4℃保存及使用。 6.10 氯化钠（sodiumchloride，NaCl)。 6.113 三氯甲烷（chloroform，CHCls）。 6.12 异丙醇[isopropylalcohol,CH，CH(OH)CH]。 6.13: 异戊醇[isoamylalcohol,（CH）CHCH,CH,OH]。 6.14 乙酸钠（sodiumacetate，NaAc)溶液：3mol/L，用乙酸调pH至5.2，不要高压灭菌（0.22μm膜过滤)。 6.15 氯仿：异戊醇：乙醇溶液（80：4：16）。 6.16DNA提取液I：100mmol/LTris-Cl,20mmol/LEDTA,500mmol/LNaCl,1.5%SDS。 6.17 DNA提取液ⅡI：18.6g葡萄糖，6.9gNazSzOs，6.0gPVP，240μLβ-巯基乙醇，加水至300mL。 6.18TE缓冲液（pH8.0)：10mmol/LTris-Cl,1mmol/LEDTA，使用HCI或NaOH调节pH。 6.19RNaseA酶溶液：10mg/mL，一20C保存，避免反复冻融。 6.2070%乙醇溶液：4℃保存及使用。 6.2110×上样缓冲液：含0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，30%甘油水溶液。
7 仪器和设备
7.1冷冻研磨机（样品冷冻，研磨都处于液氮条件下）。 7.2离心机（可以在4℃下进行离心，离心转速10000r/min以上）。 7.3水浴锅（工作范围60℃70℃）。 7.4涡旋器。 7.5平板电泳仪。
2 GB/T30988—2014
7.6 5凝胶成像系统。 7.7可调移液器（0.5μL~10μL，10μL~1000μ，100μL1000μL，0.5m~5mL）。 7.8 紫外分光光度计。 7.9 天平（精度为0.1mg）。
8提取步骤
多酚类植物基因组DNA提取按下述步骤进行：
a) 取植物新鲜嫩叶，用无菌超纯水冲洗1min，70%乙醇消毒2min，最后用无菌超纯水冲洗
2min，无菌吸水纸吸干水分，称取约0.5g（精确至0.1mg）。 b) 将干净的样品放于灭菌的样品研磨瓶中，按表1研磨机研磨条件将样品研磨成粉状，迅速用无
菌玻棒将磨碎的样品转移至预冷的含有5mLDNA提取液II的15mL离心管中，加入0.09g NazS2Os，0.2gPVP500μLβ巯基乙醇，颠倒混匀，于4℃下以5000r/min离心5min。
表1研磨机研磨条件
时间 2 min 1 min 12次/s
步骤预冷研磨频率
c) 去上清液，加人5mL预热至65℃的DNA提取液I，温和颠倒混匀，65℃温浴1h，温浴期间
每10min摇动混勾一次。 d) 将离心管放置于冰上冷却，加入1mL预冷的NaAc溶液。 e) 混匀后加入5mL氯仿：异戊醇：乙醇溶液，温和颠倒混匀（需带手套，防止损伤皮肤），冰上
静置5min～10min，使水相和有机相分层（必要时可重新混匀）。在4℃下以10000r/min离心10min，仔细移取上清液至一无菌15mL离心管中，重复该步骤。
f) 向抽提得到的上清液中加人等体积异丙醇，温和倒转数次使之混匀，一20℃放置20min，出现
絮状DNA沉淀。 g) 将絮状DNA沉淀转人含600μLTE的无菌离心管中（如DNA不形成絮状沉淀，则可在4℃
下以10000r/min离心5min，再将沉淀移人TE管中。这样收集的沉淀，往往难溶解于TE，可在60℃水浴放置15min以上，以帮助溶解）。
h) 加人RNaseA溶液至RNaseA终浓度为10μg/mL，37C温浴30min；加人0.1gPVP，加人
等体积的氯仿：异戊醇：乙醇溶液，温和颠倒混匀，10000r/min离心10min。 i) 取上清液于1.5mL灭菌离心管内，重复抽提一次。 j) 向抽提得到的上清液中加入1/10体积的NaAc溶液，加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀，
一20℃放置20min左右。 k) 在4℃下以10000r/min离心10min，弃上清液，加人1mL70%乙醇，温和颠倒离心管数次，
洗涤沉淀，重复该步骤2次。 1) 向沉淀加人500μL预冷的无水乙醇，在4℃下以10000r/min离心5s～8s。 m）弃去乙醇溶液，将离心管开盖放置于室温下，待乙醇挥发干后将DNA重溶解于200μLTE缓
冲液中。
3 GB/T 30988—2014
9 DNA纯度、浓度测试
9.1紫外分光光度法
将待测DNA溶液进行稀释，使样品溶液在260nm处的吸收值为0.1～0.5，以TE缓冲液做参比，测定样品溶液在260nm、280nm、230nm、270nm处的吸收值，计算A250/A280A260/A230，A260/A270的比值，A280/A280为1.8~1.9,A250/A2g0>2.0,A250/A270为1.1~1.3的DNA样品可视为较纯DNA。
符合上述要求后，利用A25=1相当于50μg/mL的双链DNA来计算DNA的浓度，依据测得的浓度将DNA稀释到50ng/μL~100ng/μL，一20℃保存。
注：因基因组DNA不宜反复冻融，建议将所得DNA进行多管分装，使用时取出，融化后立刻使用，使用结束后，剩
余的DNA放于4℃冰箱短期保存，时间不宜超过14d。
9.2 2琼脂糖凝胶电泳法
取2μL～5μLDNA样品溶液与1μL10×上样缓冲液混合，用超纯水补齐至10μL，在0.7%琼脂糖凝胶中以3V/cm～5V/cm恒压条件下电泳40min，用凝胶成像系统观察DNA条带，要求所得 DNA条带单一、清晰、明亮，同时可利用发出的荧光强度与DNA的浓度或质量成线性关系的特性，通过比较待测DNA条带与已知浓度DNA条带的亮度，测定待测DNA样品的浓度。
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