ICS 13.300;11.100 A80
GB
中华人民共和国国家标准
GB/T 27821—2011
化学品 细菌DNA损伤或修复试验方法
Chemicals-Bacterial DNA damage or repair test
2012-08-01实施
2011-12-30 发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局
中国国家标准化管理委员会 发布 GB/T27821—2011
前言
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准与美国环境保护局（UnitedStatesEnvironmentalProtectionAgency，USEPA）预防、农药及
有毒物质办公室（theOfficeofPrevention，PesticidesandToxicSubstances，OPPTS）的OPPTS 870.5500：1998细菌DNA（脱氧核糖核酸）损伤或修复试验（Healtheffecttestguidelines一Bacterial DNAdamageorrepairtests)（英文版）技术性内容一致。
本标准做了下列结构和编辑性修改：
介绍部分改为引言；增加了范围一章（见第1章）。
-
本标准由全国危险化学品管理标准化技术委员会（SAC/TC251)提出并归口。 本标准起草单位：中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所。 本标准主要起草人：刘清君、李朝林、林铮、史晓祎、吴维瞪。
I GB/T 27821—2011
引言
本标准参考了USEPAOPPTS870.5500：1998细菌DNA（脱氧核糖核酸）损伤或修复试验（（英文版）。该指南是美国环境保护局（UnitedStatesEnvironmentalProtectionAgency，USEPA）预防、农药及有毒物质办公室（theOfficeofPrevention，PesticidesandToxicSubstances，OPPTS）制定，用来评价农药和其他有毒物质安全性的系列测试指南之一。是OPPTS整合了三个相关部门的测试指南和要求而最终形成，这三个相关部门的测试指导分别是依据美国联邦法规（CodeofFederalRegulations，Title 4o），第一章的R部分的污染预防和有毒物质办公室（theOfficeofPollutionPreventionandToxics， OPPT）制定的测试指南和要求，美国国家情报社出版的（theNationalTechnicalInformationService， NTIS)农药规划办公室（theOfficeofPesticidePrograms，OPP）的测试指南和要求，以及世界经济合作与发展组织（theOrganizationforEconomicCooperationandDevelopment，OECD)出版的测试指南。
依据有毒物质控制法规（theToxicSubstancesControlAct，15U.S.C.2601）和联邦杀虫剂、杀真菌剂和杀啮齿类动物剂法规（theFederalInsecticide，FungicideandRodenticideAct（7U.S.C.136，et Seq.），为满足对测试数据的要求，USEPA把多套指南整合而形成一套最终的OPPTS测试指南，以降低不同测试程序引起的差异。
Ⅱ GB/T27821-—2011
化学品细菌DNA损伤或修复试验方法
1范围
本标准规定了化学品细菌DNA损伤或修复试验的试验原理、试验方法、试验步骤和试验数据及报告。
本标准适用于化学品细菌DNA损伤或修复试验。
2试验原理
细菌DNA损伤或修复试验可用来测试DNA损伤，在一套修复功能健全的菌株和修复功能缺陷菌株试验中，修复缺陷菌株的细胞死亡和生长抑制表现不同。该试验本身并不是用来测量突变事件，而是通过检测受试物与遗传物质的相互作用检测其遗传毒性。通过检测修复功能健全的菌株和修复功能缺陷菌株表现出的不同的生长抑制作用，测试化学品对修复功能健全的野生型菌株和修复功能缺陷的突变型菌株不同的致细胞死亡作用。修复功能缺陷的突变型菌株通常是一种或多种调控DNA损伤修复酶缺陷的菌株。
本测试方法可用来检测化学品是否能够与细胞DNA反应导致细胞生长抑制或致死亡作用。化学品与DNA的相互作用可以通过特异的细胞修复系统识别。本方法选择特异DNA修复基因完好和缺陷的一对菌株，由于DNA修复缺陷菌株不能修复某一化学品引起的DNA损伤，其表现为细胞趋向于生长抑制或趋向于死亡。
本方法的参考物质包括但不限于氯霉素（chloramphenicol)和甲基磺酸甲酯（methylmethanesul- fonate)。
3试验方法
3.1方法的选择
可选用不同的方法进行测试，本方法宜选用以下两种方法： a）在固相基质上进行的测试（扩散试验）； b）在液相基质上进行的测试（悬浮试验）。
3.2菌株选择 3.2.1常用菌株
宜选择大肠杆菌（EscherichiacolipolA，W3110/p3478）和枯草杆菌（Bacillussubtilisrec，H17/ M45）。也可选择其他菌株。 3.2.2菌株的准备和保存
菌株保存液的准备和保存、生长条件、菌株的鉴定以及所需表型的验证等都应采用良好的微生物试验方法，而且都应记录在案。
1 GB/T27821—2011
3.3菌株的培养
应选用良好的微生物方法，使用新鲜的细菌培养物培养细菌。记录细胞所处的生长期和细胞密度，满足实验设计的要求。 3.4代谢活化
应设置加与不加代谢活化系统的平行对照组。常用的代谢活化系统是经酶诱导剂（物)处理过的啮齿类动物的肝匀浆微粒体酶系。也可选用其他种属、组织或方法。 3.5对照组 3.5.1平行对照
每一次试验都应设置阳性对照、阴性对照和溶剂对照。 3.5.2阴性对照
阴性对照应不表现出明显的生长抑制作用（即对两种菌株的影响是相同的）。常选氯霉素。 3.5.3基因型特异对照
可选用甲基磺酸甲酯作为大肠杆菌试验的基因型特异阳性对照，选用丝裂霉索作为枯草杆菌试验的基因型特异阳性对照。 3.5.4阳性对照用来保证代谢活化系统的有效性
试验的阳性对照参考物质，包括代谢活化系统应根据试验选用的活化系统类型确定。 3.5.5其他阳性对照
可选择其他阳性对照参考物质。 3.6受试物 3.6.1溶剂
受试物、阳性对照和阴性对照都应溶解在恰当的溶剂中，试验前用溶剂稀释备用。 3.6.2染毒浓度
最初试验应选择较宽的染毒浓度范围，染毒的上限浓度的选择应根据细胞毒性的结果和受试物的溶解性来确定。受试物的细胞毒性结果受代谢活化系统的影响。对于溶解性高的无毒化学品，应根据具体情况逐步确定最高剂量。因为扩散试验的结果以获得的生长抑制作用带的直径或范围表示，所以培养血或培养板中加人的受试物的量应完全一致。如有阳性反应，应用更窄浓度范围进行重复确认。
4试验步骤
4.1扩散试验 4.1.1培养血扩散试验
培养血扩散试验可采用两种方法：
2 GB/T27821—2011
内带和外带是否都进行了测量。 5.1.4活性计数
以某一稀释度下培养血真正的计数和涂板的体积或原始滴度(细胞数每毫升)表示。不应仅提供最终的结果（如比率、差异、存活比），而不提供原始试验数据。 5.2统计评价
应选用恰当的统计方法进行评价。 5.3结果的判断 5.3.1阳性结果的判断有多个标准。其一为修复缺陷菌株出现具有统计学意义的剂量相关的抑制趋势或死亡差异。另一标准为至少在一个测试点，出现可重复的、具有统计学意义的阳性反应。 5.3.2如果某一受试物在修复缺陷菌株上未见具有统计学意义的剂量相关的抑制趋势或死亡差异，在所有的测试点，也没表现出可重复的、具有统计学意义的阳性反应，即可认为该受试物与所用试验系统中的遗传物质没有相互作用。 5.3.3在评价时应同时考虑生物学上的显著性和统计学上的显著性。 5.4测试评价
细菌的DNA损伤或修复试验既不是用来测量DNA损伤本身，也不是用来测量突变。该试验是检测DNA损伤表现出的细胞死亡或生长抑制。如果在某一试验系统中，受试物的DNA损伤试验的结果为阳性，但在另一个试验系统中为阴性，如果没有更好的试验数据，其结果很难判断。 5.5测试报告
试验报告应包含以下信息：
一所用细菌的种属；试验菌株的生长期； —一培养基的组分；
一所用制备代谢活化系统和试验所用其他方法的详细资料；处理方法，包括使用剂量和剂量选择的原理、阳性对照和阴性对照的选择原理；细胞死亡程度的判定方法；
剂量-反应关系（如果能够提供）。
N GB/T 27821—2011
参考文 献
[i]Ames,B.N.et al.Methods for detecting carcinogens and mutagens with the Salmonella/ mammalian-microsome mutagenicity test.Mutation Research.1975,31:347-364
[2] Kada,T.et al. In vitro and host-mediated rec-assay procedures for screening chemical muta- gens; and phloxine,a mutagenic red dye detected.Mutation Research.1972,16:165-174
[3]Leifer,Z. et al.An evaluation of bacterial DNA repair tests for predicting genotoxicity and carcinogenicity:A report of the U.S.EPA's Gene-Tox Program.Mutation Research.1981,87:211-297
[4J Slater,E.E.et al.Rapid detection of mutagens and carcinogens. Cancer Research.1971,3l: 970-973
1 ICS 13.300;11.100 A80
GB
中华人民共和国国家标准
GB/T 27821—2011
化学品 细菌DNA损伤或修复试验方法
Chemicals-Bacterial DNA damage or repair test
2012-08-01实施
2011-12-30 发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局
中国国家标准化管理委员会 发布 GB/T27821—2011
前言
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准与美国环境保护局（UnitedStatesEnvironmentalProtectionAgency，USEPA）预防、农药及
有毒物质办公室（theOfficeofPrevention，PesticidesandToxicSubstances，OPPTS）的OPPTS 870.5500：1998细菌DNA（脱氧核糖核酸）损伤或修复试验（Healtheffecttestguidelines一Bacterial DNAdamageorrepairtests)（英文版）技术性内容一致。
本标准做了下列结构和编辑性修改：
介绍部分改为引言；增加了范围一章（见第1章）。
-
本标准由全国危险化学品管理标准化技术委员会（SAC/TC251)提出并归口。 本标准起草单位：中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所。 本标准主要起草人：刘清君、李朝林、林铮、史晓祎、吴维瞪。
I GB/T 27821—2011
引言
本标准参考了USEPAOPPTS870.5500：1998细菌DNA（脱氧核糖核酸）损伤或修复试验（（英文版）。该指南是美国环境保护局（UnitedStatesEnvironmentalProtectionAgency，USEPA）预防、农药及有毒物质办公室（theOfficeofPrevention，PesticidesandToxicSubstances，OPPTS）制定，用来评价农药和其他有毒物质安全性的系列测试指南之一。是OPPTS整合了三个相关部门的测试指南和要求而最终形成，这三个相关部门的测试指导分别是依据美国联邦法规（CodeofFederalRegulations，Title 4o），第一章的R部分的污染预防和有毒物质办公室（theOfficeofPollutionPreventionandToxics， OPPT）制定的测试指南和要求，美国国家情报社出版的（theNationalTechnicalInformationService， NTIS)农药规划办公室（theOfficeofPesticidePrograms，OPP）的测试指南和要求，以及世界经济合作与发展组织（theOrganizationforEconomicCooperationandDevelopment，OECD)出版的测试指南。
依据有毒物质控制法规（theToxicSubstancesControlAct，15U.S.C.2601）和联邦杀虫剂、杀真菌剂和杀啮齿类动物剂法规（theFederalInsecticide，FungicideandRodenticideAct（7U.S.C.136，et Seq.），为满足对测试数据的要求，USEPA把多套指南整合而形成一套最终的OPPTS测试指南，以降低不同测试程序引起的差异。
Ⅱ GB/T27821-—2011
化学品细菌DNA损伤或修复试验方法
1范围
本标准规定了化学品细菌DNA损伤或修复试验的试验原理、试验方法、试验步骤和试验数据及报告。
本标准适用于化学品细菌DNA损伤或修复试验。
2试验原理
细菌DNA损伤或修复试验可用来测试DNA损伤，在一套修复功能健全的菌株和修复功能缺陷菌株试验中，修复缺陷菌株的细胞死亡和生长抑制表现不同。该试验本身并不是用来测量突变事件，而是通过检测受试物与遗传物质的相互作用检测其遗传毒性。通过检测修复功能健全的菌株和修复功能缺陷菌株表现出的不同的生长抑制作用，测试化学品对修复功能健全的野生型菌株和修复功能缺陷的突变型菌株不同的致细胞死亡作用。修复功能缺陷的突变型菌株通常是一种或多种调控DNA损伤修复酶缺陷的菌株。
本测试方法可用来检测化学品是否能够与细胞DNA反应导致细胞生长抑制或致死亡作用。化学品与DNA的相互作用可以通过特异的细胞修复系统识别。本方法选择特异DNA修复基因完好和缺陷的一对菌株，由于DNA修复缺陷菌株不能修复某一化学品引起的DNA损伤，其表现为细胞趋向于生长抑制或趋向于死亡。
本方法的参考物质包括但不限于氯霉素（chloramphenicol)和甲基磺酸甲酯（methylmethanesul- fonate)。
3试验方法
3.1方法的选择
可选用不同的方法进行测试，本方法宜选用以下两种方法： a）在固相基质上进行的测试（扩散试验）； b）在液相基质上进行的测试（悬浮试验）。
3.2菌株选择 3.2.1常用菌株
宜选择大肠杆菌（EscherichiacolipolA，W3110/p3478）和枯草杆菌（Bacillussubtilisrec，H17/ M45）。也可选择其他菌株。 3.2.2菌株的准备和保存
菌株保存液的准备和保存、生长条件、菌株的鉴定以及所需表型的验证等都应采用良好的微生物试验方法，而且都应记录在案。
1 GB/T27821—2011
3.3菌株的培养
应选用良好的微生物方法，使用新鲜的细菌培养物培养细菌。记录细胞所处的生长期和细胞密度，满足实验设计的要求。 3.4代谢活化
应设置加与不加代谢活化系统的平行对照组。常用的代谢活化系统是经酶诱导剂（物)处理过的啮齿类动物的肝匀浆微粒体酶系。也可选用其他种属、组织或方法。 3.5对照组 3.5.1平行对照
每一次试验都应设置阳性对照、阴性对照和溶剂对照。 3.5.2阴性对照
阴性对照应不表现出明显的生长抑制作用（即对两种菌株的影响是相同的）。常选氯霉素。 3.5.3基因型特异对照
可选用甲基磺酸甲酯作为大肠杆菌试验的基因型特异阳性对照，选用丝裂霉索作为枯草杆菌试验的基因型特异阳性对照。 3.5.4阳性对照用来保证代谢活化系统的有效性
试验的阳性对照参考物质，包括代谢活化系统应根据试验选用的活化系统类型确定。 3.5.5其他阳性对照
可选择其他阳性对照参考物质。 3.6受试物 3.6.1溶剂
受试物、阳性对照和阴性对照都应溶解在恰当的溶剂中，试验前用溶剂稀释备用。 3.6.2染毒浓度
最初试验应选择较宽的染毒浓度范围，染毒的上限浓度的选择应根据细胞毒性的结果和受试物的溶解性来确定。受试物的细胞毒性结果受代谢活化系统的影响。对于溶解性高的无毒化学品，应根据具体情况逐步确定最高剂量。因为扩散试验的结果以获得的生长抑制作用带的直径或范围表示，所以培养血或培养板中加人的受试物的量应完全一致。如有阳性反应，应用更窄浓度范围进行重复确认。
4试验步骤
4.1扩散试验 4.1.1培养血扩散试验
培养血扩散试验可采用两种方法：
2 GB/T27821—2011
内带和外带是否都进行了测量。 5.1.4活性计数
以某一稀释度下培养血真正的计数和涂板的体积或原始滴度(细胞数每毫升)表示。不应仅提供最终的结果（如比率、差异、存活比），而不提供原始试验数据。 5.2统计评价
应选用恰当的统计方法进行评价。 5.3结果的判断 5.3.1阳性结果的判断有多个标准。其一为修复缺陷菌株出现具有统计学意义的剂量相关的抑制趋势或死亡差异。另一标准为至少在一个测试点，出现可重复的、具有统计学意义的阳性反应。 5.3.2如果某一受试物在修复缺陷菌株上未见具有统计学意义的剂量相关的抑制趋势或死亡差异，在所有的测试点，也没表现出可重复的、具有统计学意义的阳性反应，即可认为该受试物与所用试验系统中的遗传物质没有相互作用。 5.3.3在评价时应同时考虑生物学上的显著性和统计学上的显著性。 5.4测试评价
细菌的DNA损伤或修复试验既不是用来测量DNA损伤本身，也不是用来测量突变。该试验是检测DNA损伤表现出的细胞死亡或生长抑制。如果在某一试验系统中，受试物的DNA损伤试验的结果为阳性，但在另一个试验系统中为阴性，如果没有更好的试验数据，其结果很难判断。 5.5测试报告
试验报告应包含以下信息：
一所用细菌的种属；试验菌株的生长期； —一培养基的组分；
一所用制备代谢活化系统和试验所用其他方法的详细资料；处理方法，包括使用剂量和剂量选择的原理、阳性对照和阴性对照的选择原理；细胞死亡程度的判定方法；
剂量-反应关系（如果能够提供）。
N GB/T 27821—2011
参考文 献
[i]Ames,B.N.et al.Methods for detecting carcinogens and mutagens with the Salmonella/ mammalian-microsome mutagenicity test.Mutation Research.1975,31:347-364
[2] Kada,T.et al. In vitro and host-mediated rec-assay procedures for screening chemical muta- gens; and phloxine,a mutagenic red dye detected.Mutation Research.1972,16:165-174
[3]Leifer,Z. et al.An evaluation of bacterial DNA repair tests for predicting genotoxicity and carcinogenicity:A report of the U.S.EPA's Gene-Tox Program.Mutation Research.1981,87:211-297
[4J Slater,E.E.et al.Rapid detection of mutagens and carcinogens. Cancer Research.1971,3l: 970-973
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