第11卷第6期 2011年12月
过程工程学报
The Chinese Journal of Process Engineering
Vol.1I No.6 Dee.2011
近平滑假丝酵母全细胞催化不对称还原反应：底(产)物抑制及其解除
乐庸堂，徐岩，穆晓清
(江南大学生物工程学院，教育部工业生物技术重点实验室，江苏无锡214122)
摘要：以不对称还原4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)制备(S)-4-氧-3-羟基丁酸乙酯(S-CHBE)为模式反应，从实验室保藏菌种中筛选获得高效生物催化剂近平滑假丝酵母(Candidaparapsilosis)CCTCCM203011，底物浓度为20g/L时产物产率达96%，光学纯度(e.e值)大于99%.底(产)物分别具有对细胞(酶)的毒害作用和对酶促反应的抑制作用，是影响不对称还原反应催化效率的主要因素。采用水-有机双相原位萃取和分批补料联用策略，原位萃取产物并控制水相底物浓度不高于4g/L，可将底物浓度提高到60g/L，产率达95%：同时采用高生物量策略，将产物总体积浓度提高到230 g/L，e.e值保持99%以上
关键词：近平滑假丝酵母；不对称还原；(S)-4-氯-3-轻基丁酸乙酯：底物分批补给；产物原位萃取
中图分类号：Q814 1前言
文献标识码：A
文章编号：1009-606X(2011)06-1038-06
(4-Chloro-3-oxo-butyrateEthyl,COBE)浓度提高到240 g/L左右；文献[18-20]也通过树脂原位吸附方法分别有
手性醇是一类重要的药物中间体或平台化合物"
利用生物催化不对称还原潜手性炭基化合物合成手性醇类具有立体选择性高、底物成本低廉、反应条件温和等优点，近年来受到广泛的研究和关注(2)，但由于高效生物催化剂获得困难及反应过程中催化效率和生产强度较低，应用于工业化生产的并不多，
高效生物催化剂的获得是生物催化的关键(3，近年来，国内外研究者通过基因挖掘4-6]、基因重组[7.别和分子改造19等基因工程技术发现了很多高效生物催化剂，但基因工程菌一般遗传稳定性较差、细胞产量低且其构建必须以野生型菌株或已知基因序列为前提，因此，以目标产物为导向筛选具有特异性催化功能的野生型微生物依然是获得生物催化剂的有效途径(10)
微生物细胞的催化效率除了受温度、pH等环境因子影响外["]，还受底(产)物的毒害和抑制作用的影响， Griffin等[12]和Shimizu等[13]分别发现极性底(产)物会造成微生物细胞死亡、催化还原反应的关键酶和辅酶循环系统失活：胡庆森114则发现高浓度产物会对酿酒酵母催化不对称还原反应造成严重的抑制作用：因此，在高底物浓度下，生物催化反应的效率一般较低，生产强度远达不到工业化要求[15],Kizaki等[7]和Ye等[16]分别用大肠杆菌高效共表达还原酶和葡萄糖脱氢酶，Kaliaperumal 等17通过提高反应细胞浓度，并结合原位萃取和分批补料等过程工程技术，将底物4-氟-3-羰基丁酸乙酯
效提高了脂肪醇、芳醇及α-羟基酸酯的产量，但引起全细胞催化不对称还原反应效率低的关键问题及反应过程中底（产）物影响全细胞催化不对称还原反应效率的相关机制并没有系统研究
本研究以全细胞催化不对称还原COBE制备他汀类药物重要合成前体(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯[(S)-4-Chloro-3-hydroxybutyrate Ethyl, S-CHBEj[211为模式反应，在筛选获得具有高立体选择性、高不对称还原能力的野生型微生物菌株的基础上，重点考察全细胞催化不对称还原反应过程中底(产)物对关键还原酶和辅酶再生循环系统的毒害和抑制作用，以工业化底物浓度和生产强度为目标，综合运用原位分离策略、分批补料策略和高生物量策略等技术手段，大幅度提高野生型生物
催化剂催化不对称还原反应产物浓度和转化效率 2实验
2.1实验材料与试剂
菌种为实验室保藏菌种
酵母培养基：葡替糖40g/L，酵母浸膏5g/L，无机盐溶液10%)，pH7.0.
细菌培养基：葡萄糖5g/L，酵母浸膏2g/L，蛋白陈10g/L，牛肉膏10g/L，无机盐溶液5%()，pH7.0.
霉菌培养基：葡萄糖20/L，酵母浸膏3g/L，蛋白陈5g/L，牛肉膏3g/L，无机盐溶液5%()，pH7.0.
收稿日期：2011-0923，修回日期：2011-11-17
基金项目：国家白然科学基金资助项目(编号：30800017)：国家高技术研究发展计划(863)基金资助项日(编号：2011AA02A209，2011AA02A210)：国家
重点基础研究发展规划(973)基金资助项日(编号：2009CB724706，2011CB710800)：高等学校学科创新引智计划(111计划)基金资助项目(编号： 111-2-06)
作者篇介：乐南(1987-)，男，期北育通山甚人，硕士研究生，生物谨化与生物转化专业，E-mail:yueyimao@163.com：穆晓清，通讯联系人，Tel:
0510-85918201,E-mail: xqmufi@163.com 万方数据