第12卷第2期 2012年4月
过程工程学报
The Chinese Joumal of Process Engineering
亲和层析介质上蛋白质偶联位点的控制方法
冯静12，黄孟军12，张贵锋，孔英俊”，高建萍，黄永东”，苏志国？
(1.北京中医药大学中药学院，北京100102：2.中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室，北京100190)
Vol.12 No.2 Apr.2012
摘要：以溶菌酶为模型蛋白，将其偶联在环氧活化的琼脂糖介质上，采用液质联用技术结合蛋白质酶切技术对琼脂糖介质表面配基蛋白的偶联位点进行了识别，考察了活化时间、偶联时间和溶液pH值对偶联位点的影响.结果表明，环氧基密度为11.34μmol/g、反应pH9.5条件下，溶菌酶偶联位点发生在k*，延长偶联反应时间蛋白配基偶联量增加，对偶联位点种类无显著影响：增加环氧基密度或提高偶联反应pH值使溶菌酶通过多种位点偶联，在pH>10.5条件下偶联位点主要发生在K",K%和K97
关键词：亲和层析介质：蛋白质配基；偶联位点；质谱分析：蛋白质酶解
中图分类号：Q503 1前言
文献标识码：A
文章编号：1009-606X(2012)02-0277-06
究仍大多以经验性探索为主，优化反应条件以提高间隔
亲和层析技术具有分离效率高、特异性强、活性损失率低和操作简便等优点，在分离纯化蛋白质药物、抗体等生物活性大分子中应用十分广泛，目标蛋白与亲和配基之间的相互作用是亲和层析的基础，对于以蛋白质为配基的亲和层析介质，蛋白配基在介质表面上的偶联位点影响其空间取向，进而影响配基与目标蛋白质之间的相互作用.因此，研究蛋白质配基在亲和介质表面的偶联位点控制方法对提高分离效率和亲和层析介质研制具有重要意义
亲和介质的制备过程涉及空白介质活化、配基偶联、封闭未偶联位点、清洗保存等步骤，其中介质活化及配基偶联过程是影响介质性能的关键，常用的介质活化方式包括环氧活化(2)、漠化氰活化(3及戊二醛活化[4) 等.偶联过程主要受活化基团密度、偶联反应pH值、偶联温度、偶联时间等影响.目前与亲和介质相关的研
臂密度及偶联的亲和配基密度和活性等[5-7，探索亲和配基在介质表面上的空间取向和偶联位点存在一定难度，
Keigo等[8]曾尝试利用飞行时间二级离子质谱(TOF-SIMS-MS)研究以化学交联法和生物固定法将溶菌酶蛋白偶联于修饰后的载玻片上的蛋白连接取向，该方法仅能获得在界面暴露的蛋白信息，并推断其发生偶联反应的蛋白侧面，不能明确给出蛋白发生偶联的具体氨基酸位点，受仪器采样深度影响，该方法的样品采集深度仅为2nm，不适合研究所有界面偶联蛋白的构象及连接位点.Luigi等[10]、Helen等[]分别尝试采用核磁共振技术(NMR)和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)研究蛋白在材料表面吸附的位点，但在定量分析方面存在局限性，
高效液相-质谱技术(HPLC-MS)及蛋白质酶解技
Indirect method
2
Chymotrypsin digestion Direct method
图1蛋白酶解结合HPLC-MS识别介质表面蛋白偶联位点流程图 Fig.1 Schematic diagram of identification of the coupling site of protein on
chromatographic media using enzymatic digestion and HPLCMS
收稿日期：20120213，修回日期：20120320
基金项目：国家自然科学基金资助项目(编号21076215：20906094：20820102036)
作者简介：冯静(1986-)，女，河北省石家庄市人，硕士研究生，微生物与生化药学专业，张费锋，通讯联系人，Tel:010-82613421,E-mail:
gfzhang@home.ipe.ac.cn 万方数据