SN ICS 65.020.01 CCS B 16
中华人民共和国出入境检验疫行业标准
SN/T 4876.9—2022
DNA 条形码方法第9部分：检疫性大小蠹Method for DNA barcode—Part 9:Dendroctonus
2022-07-07发布
2023-02-01实施
发 布
中华人民共和国海关总署
SN/T 4876.9—2022
DNA条形码方法第9部分：检疫性大小蠹
1 范围
本文件规定了用DNA条形码试剂盒检测技术对中国进境植物检疫性大小蠹进行基因条码筛查的鉴定方法。
本文件适用于国境口岸开展检疫性大小蠹种类分子鉴定的植物检疫实验室。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
SN/T4174 美云大小蠹检疫鉴定方法
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
DNA 条形码 DNA barcoding
DNA条形码技术是利用标准化的、有足够变异的、易扩增且相对较短的基因片段，用于物种鉴定和新种发现的生物身份识别技术。3.2
线粒体DNA mitochondrial DNA
简称mtDNA，线粒体中的遗传物质，是在细胞线粒体内发现的脱氧核糖核酸特殊形态。线粒体基因组是棵露的DNA双链分子，主要呈环状，可参与蛋白质的合成，转录与复制。特点是突变率高，母系遗传。3.3
细胞色素氧化酶亚基I cytochrome oxidase subunit I
由线粒体DNA编码，基因总长约1544bp的一类细胞色素氧化酶亚基。3.4
凭证标本 voucher specimen
凭证标本是一种为鉴定或研究提供实物依据并具有足够存档信息（采集及鉴定信息等）而长期保存的标本，它可以是完整的生物个体或其一部分，也可以是生物体的遗传物质。模式标本也属凭证标本。凭证标本记录的存档信息应具有追溯性。
4 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
SN/T 4876.9—2022
COI：细胞色素氧化酶亚基ⅠDNA：脱氧核糖核酸PCR：聚合酶链式反应ddHO：双蒸水μL：微升mg/mL：毫克/毫升
TE缓冲液：Tris-EDTA缓冲液TAE缓冲液：Tris-乙酸缓冲液r/min转/分钟
5 检疫性大小蠹基本信息
原农业部2007年5月29日发布的第862号公告《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》中将大小蠹（红脂大小蠹和非中国种）Dendroctonus spp.（valens LeConte and non-Chinese）列为我国进境植物检疫性有害生物。大小蠹属Dendrotonus 昆虫隶属于鞘翅目Coleptera、小蠹科 Scolytidae、海小蠹亚科 Hylestininae、根小蠹族 Hylurgini。该属在全世界共记录19种，其中北美洲分布17种，欧洲和亚洲共2种。我国本土的大小蠹仅有华山松大小蠹 Dendroctomus armandi 和云杉大小蠹D.micans，主要分布在陕西、四川、黑龙江、辽宁和青海省（参见附录表A.1）。
6 方法原理
形态学上符合大小蠹属昆虫形态特征的未知大小蠹，根据其COI基因序列特征及多态位点规律，作为物种的鉴定特征，确定目标大小蠹是否为检疫性大小蠹。
7 器材和试剂7.1 器材
至少应配置以下仪器设备：
常规PCR仪；微量分光光度仪；核酸电泳仪凝胶成像系统；台式冷冻离心机；超纯水系统；旋涡振荡器；微量移液器（0.5μL，2.5μL，10μL，20μL，200μL，1000μL）及配套抢头；PCR反应管（0.2mL，0.5mL）；冰箱；体视显微镜。7.2 试剂
应至少购置如下试剂或者相应的动物基因组提取试剂盒：
裂解缓冲液；TE 缓冲液；TAE 缓冲液；蛋白酶K；EB；琼脂糖；ExTag聚合酶；DL2000 Marker；PCR MasterMix；引物。
本文件使用的扩增引物为ZINK3/ZINK2，上游引物ZINK3：TAGATGTGGACACCCGAGCCT，下游引物ZINK2：AGTTAGTCCTGCGAAGAG，产物大小为325 bp。
8 DNA条形码鉴定8.1 样品的采集与处理
样品的采集见SN/T 4174美云大小蠹检疫鉴定方法。