SN ICS 67.050 CCS X 04
中华人民共和国出入境检验疫行业标准
SN/T 5438—2022
出口乳粉中核苷酸含量的测定液相色谱-质谱/质谱法Determination of nucleotide in milk powder for export—LC-MS/MS method
2022-03-14发布
2022-10-01实施
发 布
中华人民共和国海关总署
SN/T 5438—2022
出口乳粉中核苷酸含量的测定液相色谱-质谱/质谱法
1 范围
本文件规定了游离核苷酸含量的液相色谱-质谱/质谱测定方法。
本文件适用于乳粉和调制乳粉中游离核苷酸总量（包括胞嘧啶核苷酸、尿嘧啶核苷酸、次黄嘌呤核苷酸、鸟嘌呤核苷酸、腺嘌呤核苷酸5种核苷酸）的测定。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件，不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB 19644—2010 食品安全国家标准 乳粉
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
乳粉 milk powder
以生羊、牛乳为原料，经加工制成的粉状产品（见GB 19644——2010）。3.2
调制乳粉 formulated milk powder
以生牛（羊）乳或及其加工制品为主要原料，添加其他原料，添加或不添加食品添加剂和营养强化剂，经加工制成的乳固体含量不低于70%的粉状产品（见GB19644——2010）。3.3
游离核苷酸 free nucleotide
以核苷酸分子独立形态存在生物体内的物质，包括胞嘧啶核苷酸、尿嘧啶核苷酸、次黄嘌呤核苷酸、鸟嘌呤核苷酸、腺嘌呤核苷酸5种核苷酸。3.4
蛋白质沉淀 protein precipitation
一种样品前处理方法。通过向样品中加入可混溶的有机溶剂致使蛋白质沉淀。3.5
多反应监测 multiple reaction monitoring（MRM）
一种在串联质谱中使用的定量分析方法，通过在串联质谱仪的第一级（Q1）锁定母离子并在第三级（Q3）锁定子离子来测定分析物。SN/T 5438—2022
4 方法提要
采用水提取试样中的核苷酸，甲酸沉淀蛋白质后，液相色谱-质谱/质谱仪检测和确证，外标法定量。
5 试剂和材料
水采用GB/T 6682规定的一级水。5.1 乙腈：色谱纯。5.2 甲酸：色谱纯。
5.3 1%甲酸水溶液：准确吸取10 mL甲酸（4.2），用水定容至1L，混匀。5.4 0.1%甲酸水溶液：准确吸取1mL甲酸（4.2），用水定容至1L，混匀。5.5 标准物质：核苷酸标准品（具体信息参见附录A），纯度均大于99%。
胞嘧啶核苷酸 Cytidine monophosphate（CMP） C.H1.NJO。P 腺嘌呤核苷酸 Adenosine monophosphate（AMP）C...H.AN；O.P 尿嘧啶核苷酸 Uridine monophosphate（UMP） C，HNOP 鸟嘌呤核苷酸 Guanosine monophosphate（GMP）CuHIAN；O。P 次黄嘌呤核苷酸 Inosine monophosphate（IMP） CuHIsNo.P
5.6 标准储备液的配制：分别准确称取经纯度折算后的适量标准物质（精确到0.1 mg），用水溶解，难溶的标准品，加少量1%甲酸水溶液（4.3）溶解，再用水定容至刻度，配制成浓度为1.0 mg/mL的标准储备溶液。于4℃以下避光保存，有效期6个月。
5.7 混合标准溶液的配制：准确吸取标准储备液0.5mL于10mL容量瓶中，用水定容至刻度，此标准溶液浓度为50.0mg/L，于4℃以下冰箱内储存，有效期1个月。5.8 微孔滤膜：0.22μm，有机相型。
6 仪器和设备
6.1 液相色谱-质谱/质谱联用仪：配有电喷雾离子源（ESI）。6.2 超声波水浴。6.3 涡旋混合器。
6.4 低温离心机：可制冷至4℃，10000r/min。6.5 均质器。
6.6 分析天平：感量0.1mg和0.001g。6.7 聚丙烯离心管：50mL，具塞。
6.8 移液枪，10 μL～1 000 μL，10 μL～100μL，1 000μL～5 000 μL。
7 测定步骤7.1 提取
称取5.0 g均匀样品（精确至0.01 g），加30 mL水，振荡、超声至完全溶解，转移至100 mL容量瓶中，定容至刻度；取20 mL样品溶液转移至50 mL容量瓶中，定容至刻度，获得稀释样品溶液；取5mL 稀释试样于50mL容量瓶，加入120μL～150μL1%甲酸溶液（4.3），超纯水定容至刻度线，置于超声波清洗器中超声波提取10 min后（调制乳粉样品不超声直接静止30min，提取核苷酸），在4℃下离心