NY/T 2960-2016
兔病毒性出血病病毒RT-PCR检测方法
Detecting method for rabbit haemorrhagic disease virus by RT-PCR
2017-04-01实施
2016-10-26发布
前 言
本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。
本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC 181）归口。
本标准起草单位∶中国动物卫生与流行病学中心、江苏省农业科学院兽医研究所、河南牧业经济学院。
4.9 焦碳酸二乙酯（DEPC）水，见A.3。
警告∶DEPC对眼睛和呼吸道黏膜有强刺激，在操作中应在通风条件下进行。使用时戴手套和口罩，不小心沾到皮肤应立即冲洗。
4.10 异丙醇∶一18℃以下预冷。
4.11 75%乙醇∶-18℃以下预冷。
4.12氯仿。
警告∶氯仿毒性属中等毒性，吸入或经皮肤吸收会引起人体不适及皮肤黏膜刺激症状，在操作中应在通风条件下进行。使用时戴手套和口罩，不小心沾到皮肤应立即冲洗。
4.13 DNA分子量标准（DL.2000 DNA Marker）。
4.14 6×电泳上样缓冲液。
5 引物
5.1 反转录引物见B.1。
5.2 PCR引物见B.2。
6 操作程序
6.1 样品的采集及处理过程的注意事项
采样过程中样本不得交叉污染，采样、样品处理及 RNA提取过程中应戴一次性手套和口罩。
6.2 样品的采集及处理
6.2.1 肝脏等脏器的采集和处理
无菌取疑似RHD死亡兔肝脏等脏器5g，分别剪碎作为检测样品。同时，以RHD死亡兔和正常兔肝脏等脏器分别作为阳性和阴性对照样品，同样处理。—18℃以下冰箱可保存1个月。运输过程中需加冰袋保存。
6.2.2 鼻腔分泌物的采集和处理
用DEPC水润湿棉签拭子，深人兔鼻腔内部涂抹数次，然后放到含0.2 mL.DEPC水的 EP管中。—18℃以下冰箱可保存1个月。运输过程中需加冰袋保存。
6.3 RNA的提取
6.3.1 TRIZOL法
实验室没有商品化 RNA提取试剂盒采用此方法。
将5倍样品量的 DEPC水加入脏器组织中，研磨成悬液，装入 DEPC处理过的 EP管中，-18℃以下反复冻融3次.5000 g 离心5min.取200μL上清液作为待提取样品（浸泡于EP管中的棉签拭子，经反复挤压5次后.5000g离心5min，取200μL上清液作为待提取样品）。然后.加入700μl TRIZOL，振荡混匀后;室温放置10 min，加入氯仿300 μL。振荡混匀后;室温放置 30 min，4℃ 10000g离心15 min。取上层水相600μ加入等体积的异丙醇，混匀，-18℃以下放置2h以上或过夜，4℃ 10000g离心15min.去上清液，缓缓加入75%乙醇1mL.洗涤，4℃5000g离心5min.去上清液，室温干燥20 min，加入DEPC水 10 μL，使充分溶解。
6.3.2 试剂盒法
实验室有商品化 RNA提取试剂盒采用此方法。