NY/T 3475-2019
饲料中貂、狐、貉源性成分的定性检测实时荧光PCR法
Identification of martes, fox and Nyctereutes procyonoides-originated ingredients in feeds—Real time PCR method
2019-11-01实施
2019-08-01发布
前 言
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。
本标准由农业农村部畜牧兽医局提出。
本标准由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC 76）归口。
本标准起草单位;山东省饲料质量检验所。
5 原理
用裂解液裂解试样中的细胞，用三氯甲烷去除蛋白等杂质，再用异丙醇沉淀得到 DNA，进一步用乙醇溶液纯化 DNA。用特异性检测引物和探针对 DNA进行实时荧光 PCR扩增，根据扩增曲线与 Ct值对试样中貂、狐、貉源性成分进行定性检测。
6 试剂或材料
除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂。所有试剂溶液均用无 DNA酶和 RNA酶污染的容器分装。
6.1 水∶符合GB/T6682 规定的一级水。
6.2 异丙醇。
6.3 蛋白酶K（20mg/mL）。
6.4 Tag DNA聚合酶（5 U/μL）。
6.5 dNTP 溶液（含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2.5 mmol/L）。
6.6 MgCl∶溶液（25 mmol/L）。
6.7 10× PCR缓冲溶液。
6.8 Tris-HCl溶液（1 mol/L）;称取121.1g Tris;加 800 mL水溶解，冷却至室温后，用浓盐酸调节溶液的 pH至8.0，加水定容至1 L，121℃高压灭菌20 min备用。
6.9 EDTA溶液（500 mmol/L）;称取186.1g EDTA-Naz·2H2O.加800 mL水溶解，，用10 mol/L氢氧化钠溶液调节溶液的 pH至8.0，加水定容至1L，121℃高压灭菌 20 min 备用。
6.10 CTAB裂解溶液∶称取10.02g CTAB、40.91g NaCl，加 800 mL水溶解，加入50 mL Tris-HCl溶液（6.8）和20 mL EDTA溶液（6.9），用水定容至1L，121℃高压灭菌20min备用。
6.11 TE缓冲溶液∶在800 mL水中，依次加入10 mL Tris-HCl溶液（6.8）和2 mL EDTA溶液（6.9），用水定容至1L，121℃高压灭菌 20 min 备用。
6.12 检测用引物和探针序列见附录 A。
6.13 乙醇溶液;无水乙醇十水=7十3。
6.14 三氯甲烷和异戊醇混合溶液;三氯甲烷十异戊醇=241。
6.15 基因组 DNA提取试剂盒。
7 仪器设备
7.1 实时荧光 PCR仪。
7.2 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计∶波长（260±1）nm，（280±1）nm。
7.3 分析天平∶感量0.1mg。
7.4 台式离心机∶转速不低于12000 r/min。
7.5 恒温水浴锅∶65℃，精度为±1℃。
7.6 高压灭菌锅。
7.7 涡旋振荡器。
8 样品