GB/T 40249-2021
斑节对虾杆状病毒病诊断规程PCR检测法
Code of diagnosis for infection with Penaeus monodon-type baculovirus—PCR method
2021-12-01实施
2021-05-21发布
前 言
本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分∶标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由中华人民共和国农业农村部提出。
本文件由全国水产标准化技术委员会（SAC/TC156）归口。
1 范围
本文件规定了斑节对虾杆状病毒病诊断规程中普遍适用的核酸检测技术的要求.针对斑节对虾杆状病毒（Penaeus monodon-type baculovirus，MBV），给出了PCR 检测法所需试剂或材料、仪器设备、样品、试验步骤和结果判定。
本文件适用于对虾各生活期样品中 MBV带毒情况的定性检测，以进行斑节对虾杆状病毒病的流行病学调查、诊断、检疫和监测。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 28630.4—2012 白斑综合征（WSD）诊断规程 第4部分∶组织病理学诊断法
3 术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4 缩略语
5 试剂或材料
5.1 除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。
5.2 无水乙醇。
5.3 TE缓冲液∶按附录A中 A.3 配制。
5.4 抽提缓冲液∶按A.6 配制。
5.5 蛋白酶K∶按A.7 配制。
5.6 10 mol/L 乙酸铵∶按A.8 配制。
5.7 Tirs饱和酚（pH≥>7.8）。
5.8 酚/氯仿/异戊醇（25∶24∶1）。
5.9 氯仿/异戊醇（24∶1）。
5.10 1×电泳缓冲液∶按 A.10 配制。
5.11 70%乙醇∶按 A.11配制。
5.12 dNTPs（各2.5 mmol/L）;生化试剂·含dATP、dTTP、dGTP、dCTP各 2.5mmol/L的混合物∶一20℃ 保存，用于PCR。
5.13 10×PCR缓冲液∶生化试剂，无 Mg2离子，-20 ℃保存。
5.14 MgCl（25 mmol/L）∶生化试剂，—20 ℃保存。
5.15 Tag DNA聚合酶（5 U/μL）∶∶生化试剂，20℃保存。
5.16 引物 261F（10 mol/L）∶5'-AAT-CCT-AGG-CGA-TCT-TAC-CA-3'，-20 ℃保存。
5.17 引物 261R（10 μmol/L.）;5'-CGT-TCGTTG-ATG-AAC-ATC-TC-3'，-20 ℃保存。
5.18 内参引物 CF（10μmol/L）∶5'-TGC-CTT-ATC-AGC-TNT-CGA-TTG-TAG-3'，-20 ℃保存。
5.19 内参引物CR（10 μmol/L）∶5'-TTC-AGN-TTT-GCA-ACC-ATA-CTT-CCC-3'，-20℃保存。
5.20 PCR 检测阳性对照;为已知受 MBV感染且 PCR结果显示阳性的对虾组织样品一80 ℃保存。5.21 PCR 检测阴性对照∶为已知未受 MBV感染且 PCR结果显示阴性的对虾组织样品，一80 ℃保存。
5.22 PCR 检测空白对照∶灭菌双蒸水。
5.23 琼脂糖∶生化试剂。5.24 DNA分子量标准∶生化试剂。
5.25 6×载样缓冲液∶生化试剂。
5.26 10 mg/mL EB贮存液∶按 A.12 配制，或其他等效产品。