ICS 65.020.20 3707
CCS B 16
潍
坊 市 地 方 标 准
DB3707/T 133—2024
西瓜枯萎病菌鉴定技术规程
Technical code of practice for identification of watermelon fusarium wilt
pathogen
2024 - 12 - 19 发布
2025 - 01 - 20 实施
潍坊市市场监督管理局 发 布
DB3707/T 133—2024
目
次
前言 .................................................................................. II
1 范围 ................................................................................. 1
2 规范性引用文件 ....................................................................... 1
3 术语和定义 ........................................................................... 1
4 鉴定程序 ............................................................................. 1
5 田间取样 ............................................................................. 2
6 症状检查 ............................................................................. 2
7 病原菌的鉴定 ......................................................................... 3
8 过程记录及档案保存 ................................................................... 4
附录 A（资料性） 西瓜枯萎病危害症状 .....................................................5
附录 B（资料性） 马铃薯蔗糖琼脂培养基（PSA）配制方法 ....................................6
附录 C（规范性） 西瓜枯萎病菌致病性测定 .................................................7
附录 D（资料性） 西瓜枯萎病菌菌落形态及分生孢子形态特征 .................................8
附录 E（资料性） 西瓜枯萎病菌 DNA 的提取 .................................................9
附录 F（资料性） 西瓜枯萎病菌 PCR 检测 ..................................................10
参考文献 .............................................................................. 11
I
DB3707/T 133—2024
前
言
本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则
起草。
第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由潍坊市农业农村局提出、归口并组织实施。
本文件起草单位：优奈尔生物科技有限公司、潍坊郭牌农业科技有限公司、潍坊市农业科学院。
本文件主要起草人：由守昌、杨猛、金炳奎、王昌盛、徐立功、孙继峰、刘金宝、王海艳、王逍逍、
杨珊、辛国凤、杨琪、邢石磊。
II
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西瓜枯萎病菌鉴定技术规程
1
范围
本文件确立了西瓜枯萎病菌鉴定技术程序，规定了田间取样、症状检查、病原菌的鉴定、过程记录
及档案保存的指示，以及上述阶段之间的转换条件，描述了过程记录、建立档案等追溯方法。
本文件适用于西瓜枯萎病菌的检测和鉴定。
2
规范性引用文件
本文件没有规范性引用文件。
3
术语和定义
SN/T 2589-2010界定的以及下列术语和定义适用于本文件。
3.1
症状
symptom
植物受病原物或不良环境因素的侵扰后，内部的生理活动、外观或生长发育所显示的某种异常状态。
[来源：SN/T 2589—2010，定义3.2]
4
鉴定程序
西瓜枯萎病菌鉴定技术规程包括田间取样、症状检查、病原菌的鉴定、过程记录及档案保存4个阶
段。程序流程如图1所示。
1
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图1
西瓜枯萎病菌鉴定流程图
5
田间取样
宜选择在西瓜枯萎病发病初期至病情发展到一定程度（但尚未完全枯死）的植株。取样时，应戴好
一次性手套，小心地将根部从土壤中取出，随后迅速将样本植株放入密封的塑料袋或适宜容器中。在低
温条件下运输至实验室，如将样品放置在放有冰袋的泡沫盒中或4 ℃～8 ℃冷藏小冰箱内。运输过程中
应严格避免样本受到挤压、碰撞和震动，可在容器内放置缓冲材料，如柔软的泡沫或海绵等。
6
症状检查
6.1
症状检查操作如下:
a) 观察病株叶部有无西瓜枯萎病的可疑症状（见附录A），如出现叶片萎蔫、发黄、干枯等。
2
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b)
用小刀进行纵切和横切病株根部病健交界处，观察有无西瓜枯萎病的可见症状（见附录A），
如基部有褐色条斑或发生表皮纵裂、维管束变褐等。
6.2
样本在经详细登记（包括样本来源、取样时间、取样地点等信息）和经手人签字后，应存放在 4 ℃
冰箱中冷藏，以备复核。当保存期满后，应采用高压灭菌处理后再行处置。应建立样本保存数据库，记
录每个样本的保存位置、保存时长等信息。
7 病原菌的鉴定
7.1 实验用仪器设备和主要试剂的准备
7.1.1 实验仪器
实验仪器包括生物显微镜、超净工作台、高压灭菌锅、高速冷冻离心机、PCR仪、凝胶成像仪、电
泳仪、恒温培养箱、-80 ℃超低温冰箱、4 ℃冰箱、-20 ℃冰箱、组织破碎仪、微量移液器（0.1 μL～
2.5 μL、1 μL～10 μL、10 μL～100 μL、20 μL～200 μL、100 μL～1 000 μL）等。
7.1.2
主要试剂
除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。
——1% NaClO、75%酒精、30%灭菌甘油、灭菌石蜡油、琼脂、DNA提取相关试剂、PCR相关试剂、电
泳相关试剂等。
——试验中除PCR试验所用的试剂配制为三级水外，其他用水均为一级水。
——马铃薯蔗糖琼脂培养基（PSA）（配制方法见附录B）。
7.2
病原菌的培养
7.2.1
直接培养
将样本根部用75%酒精进行消毒处理30 s后，用无菌水冲洗3遍，用1%琼脂进行保湿，置于28 ℃条
件下培养2 d～4 d。
7.2.2
分离培养
将病株根部或茎部病健交界处切成5 mm左右的小块，在1% NaClO溶液中浸泡2 min，用75%酒精浸泡
15 s，无菌水冲洗3次，灭菌滤纸片吸干水分后放置在PSA培养基上，用parafilm膜封口，置于28 ℃恒
温培养箱中倒置培养1 d～3 d。用挑针挑取单根菌丝接种到新鲜PSA培养基上纯化培养5 d。按照附录C
的规定将病原菌接种到健康植株上进行致病性测定，并密切观察植株在接种后的发病情况，如发病时间、
症状表现等。
7.3
形态学鉴定
用灭菌牙签挑取按照7.2条培养获得的菌丝及分生孢子，制成临时玻片，在生物显微镜下观察分生
孢子形态特征（见附录D）。
病菌在PSA培养基平板上菌落突起，白色致密呈絮状，菌丝体为有隔菌丝、无色，在培养基上培养4
d～5 d后出现粉红色，小型分生孢子无色、长椭圆形、单胞或偶有一个分隔。大型分生孢子镰刀形、无
色、有1个～5个隔膜、多数为3个隔膜。
7.4
分子生物学鉴定
3
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将分离出的可疑菌落，接种到PSA培养基上，28 ℃培养5 d，用无菌手术刀刮取菌丝，用CTAB法（见
附录E）提取可疑分离物DNA。将提取得到的DNA用ITS1/ITS4、EF1-728F/EF1-986R、CYLH3F/CYLH3R、
ACT-512F/ACT-783R作为引物分别扩增病原菌菌株的核糖体内部转录间隔区（the nuclear ribosomal
internal transcribed spacer region，ITS）、翻译延伸因子（translation elongation factor 1-a，
TEF-1）、组蛋白（histone H3，HIS）、肌动蛋白基因（actin genes，ACT）。将所获得的片段提交测
序，并根据参考序列信息构建系统发育树（见附录F），从而确定可疑分离物的种类。
7.5
结果判定
应采用形态学检测和分子生物学鉴定相结合的方法，进行结果判定。
a)
分离菌株的培养性状和形态特征符合7.3条描述，且根据ITS、TEF-1、HIS、ACT序列构建的系
统发育树，与西瓜枯萎病菌参考菌株序列构建的系统发育树能够聚到一个分支上，且置信度
大于95%，可判定检出西瓜枯萎病菌Fusarium oxysporum f. sp. niveum（FON）。
b)
分离菌株的培养性状和形态特征符合7.3条描述，但根据ITS、TEF-1、HIS、ACT序列构建的系
统发育树，与西瓜枯萎病菌参考菌株序列构建的系统发育树，能够聚到一个分支上，但置信
度不大于95%或不能够聚集到一个分支上，可判定未检出西瓜枯萎病菌Fusarium oxysporum f.
sp. niveum（FON）。
c)
分离菌株的培养性状和形态特征不符合7.3条描述，可判定未检出西瓜枯萎病菌Fusarium
oxysporum f. sp. niveum（FON）。
7.6
病原菌的保存
从检测样品中分离并鉴定为西瓜枯萎病菌的菌株应妥善保存。将菌株接种于PSA培养基斜面上，在
28 ℃下培养3 d后加入灭菌石蜡油，于4 ℃冰箱中保存，保存期间定期检查菌株的存活情况和生长状态，
如每隔一个月观察一次菌落形态、颜色等变化；或将菌丝块转入30%灭菌甘油中，使用液氮速冻后置于
-80 ℃超低温冰箱中冷冻保存；或收集菌丝进行真空干燥后于-20 ℃冰箱中低温保存。
7.7
试验结果记录
在接种过程中，准确记录接种时间、接种部位、接种量等信息；在病原菌的形态学鉴定和分子生物
学鉴定过程中，应保存相应的菌落照片、孢子照片、详细记录实验条件（如温度、时间、试剂用量等）
和结果（如电泳条带的大小、测序结果等），同时保存相关的图像资料（如电泳图谱、测序峰图等）等；
样品保存过程中，应记录液氮的使用量、速冻时间以及超低温冰箱的温度波动情况、干燥的温度、真空
度、干燥时间等参数信息。
8
过程记录及档案保存
完整的试验记录应涵盖样品的来源（包括种植地点、品种等详细信息）、种类、取样时间、试验的
起始和结束时间、试验地点、所采用的方法（包括田间取样方法、培养条件、鉴定方法等详细步骤）和
结果（包括症状观察结果、病原菌培养结果、鉴定结果等）等内容，并且每份记录都应有试验人员和审
核人员的签字确认。
4
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附 录 A
（资料性）
西瓜枯萎病危害症状
西瓜枯萎病在西瓜生长的各个时期均可发病，伸蔓期至开花坐果期是西瓜枯萎病敏感期。幼苗发病
时呈立枯状，病株茎蔓上的叶片自基部向上逐渐萎蔫，似缺水状，中午更明显。最初1 d～2 d，早晚尚
能恢复正常，数日后，植株萎蔫不再恢复，慢慢枯死。成株期发病，病株生长缓慢，下部叶片发黄，逐
渐向上发展。开始白天萎蔫，早晚恢复，数日后全株萎蔫枯死。病蔓基部常有褐色条斑或发生表皮纵裂，
并伴有树脂状胶质溢出，茎部维管束变成褐色。潮湿时，茎部呈水浸状腐烂，表面出现白色至粉红色霉
状物。西瓜枯萎病危害症状见图A.1。
a)
病株症状 b) 病株维管束病状
图A.1
西瓜枯萎病田间发病症状
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附 录 B
（资料性）
马铃薯蔗糖琼脂培养基（PSA）配制方法
将洗净后去皮的马铃薯200 g切成1 cm左右的小块，加水1 000 mL煮沸20 min，用4层纱布过滤去除
马铃薯泥，然后加入20 g蔗糖，融化后定容至1 000 mL，加入10 g～15 g琼脂后加热使琼脂完全溶化，
将配制好的培养基分装到三角瓶中，塞好棉塞后用牛皮纸袋包裹，置于121 ℃高压灭菌20 min。
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附 录 C
（规范性）
西瓜枯萎病菌致病性测定
选取疑似枯萎病或者测序结果为枯萎病菌的纯培养菌落，采用浸根法接种。
将处于子叶平展期的西瓜苗根系漂洗干净后，在6×10
6个孢子·mL
-1的孢子悬浮液中浸根15 min，
期间摇动孢子悬浮液3次。对照植株在无菌水中浸根15 min。接种后幼苗移栽至经过121 ℃高压湿热灭
菌2 h的过筛土和草炭（1:1）混合的基质中。在人工气候室中培养，温度26 ℃/22 ℃（日/夜），光照
14 h/10 h（日/夜），相对湿度60%，每个处理接种6株，3次重复，接种3 d后剔除萎蔫和枯死的幼苗。
接种4 d后开始调查记录发病情况，21 d内持续观察幼苗发病情况以确认分离菌株的致病性。
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附 录 D
（资料性）
西瓜枯萎病菌菌落形态及分生孢子形态特征
西瓜枯萎病病原为尖孢镰刀菌西瓜专化型Fusarium oxysporum f. sp. niveum（FON），属半知菌
亚门真菌。病菌产生三种类型的孢子。病菌在PSA培养基平板上菌落突起，白色致密呈絮状，菌丝体为
有隔菌丝、无色，在培养基上培养4 d～5 d出现粉红色，小型分生孢子无色、长椭圆形、单胞或偶有一
个分隔。大型分生孢子镰刀形、无色、有1个～5个隔膜、多数为3个隔膜。西瓜枯萎病菌菌落形态及分
生孢子形态特征见图D.1。
a)
c)
菌落正面形态 b) 菌落背面形态
大型分生孢子 d) 小型分生孢子
图D.1
西瓜枯萎病菌形态
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附 录 E
（资料性）
西瓜枯萎病菌 DNA 的提取
DNA提取步骤如下：
a)
将待测菌株于28 ℃恒温培养箱中培养5 d后，收集菌丝；
b)
将收集的菌丝，放入含有破碎珠的破碎管中，将CTAB提取缓冲液加入到破碎管中，拧紧盖子后，
放于组织破碎仪中进行破碎；
c)
将破碎管放于65 ℃水浴锅中，孵育30 min，中间颠倒混匀2次；
d)
加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（体积比为25:24:1），混匀，12000 rpm/min，4 ℃离心10 min；
e)
吸取上清液至1.5 mL离心管中，重复步骤d）一次；
f)
加入2倍或2.5倍的预冷无水乙醇和1/10 3M NaAc（pH 5.2）（或用0.6倍的预冷异丙醇沉淀），
室温沉淀20 min，12 000 rpm/min离心10 min；
g)
用70%的乙醇洗涤沉淀两次；
h)
真空干燥或放入超净工作台自然吹干后，用40 μL去离子水（或含RNase）进行溶解，用Nanodrop
检测DNA的纯度和浓度后，保存于-20 ℃冰箱中备用。
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附 录 F
（资料性）
西瓜枯萎病菌 PCR 检测
F.1
PCR：以所提取的真菌基因组 DNA 为模板，用 ITS1/ITS4、EF1-728F/EF1-986R、CYLH3F/CYLH3R、
ACT-512F/ACT-783R 为引物分别扩增真菌的 ITS、TEF-1、HIS、ACT 基因（见表 F.1）。
表 F.1 真菌鉴定用引物信息
扩增基因 引物名称 引物序列 退火温度（℃） 扩增片段大小（bp） 参考文献
ITS ITS1 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’ 54 500-750 White et al.，1990
ITS4 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’
EF EF1-728F 5’-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3’ 52 300-450 Carbone &Kohn，1999
EF1-986R 5’-TACTTGAAGGAACCCTTACC-3’
ACT ACT-512F 5’-ATGTGCAAGGCCGGTTTCGC-3’ 56 300-450 Crous et al.，2004
ACT-783R 5’-TACGAGTCCTTCTGGCCCAT-3’
HIS CYLH3F 5’-AGGTCCACTGGTGGCAAG-3’ 54 350-400 Carbone &Kohn，1999
CYLH3R 5’-AGCTGGATGTCCTTGGACTG-3’
反应体系：
基因组DNA（20 ng）
1 μL
Forward Primer （10 μmol·L
-1）
2 μL
Reverse Primer（10 μmol·L
-1）
2 μL
2×Premix rTaq
25 μL
DDW
Add up to 50 μL
反应程序：
94 ℃ 4 min
94 ℃ 30 s 34 cycles
52 ℃～56 ℃ 30 s
72 ℃ 30 s
72 ℃ 10 min
将 PCR 产物用 1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。
F.2
测序：将 PCR 产物提交测序公司进行测序。
F.3
序列比对：根据参考序列信息，利用 MEGA 5.05 软件采用最大似然法（Maximum Likehood，ML）
构建多基因联合系统发育树，并用 Bootstrap 法评估系统发育树的置信度，重复次数为 1 000 次。
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[1] SN/T 2589 参 考 文 献
植物病原真菌检测规范

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