ICS 65.020.20
CCS B 05 13
河
北 省 地 方 标 准
DB 13/T 6010—2024
番茄抗病种质资源一年多代快速培育
技术规程
2024 - 10 - 28 发布
2024 - 11 - 28 实施
河北省市场监督管理局 发 布
DB 13/T 6010—2024
前
言
本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规
定起草。
本文件由河北省农业农村厅提出。
本文件起草单位：河北省农林科学院经济作物研究所、河北省农业项目规划中心。
本文件主要起草人：李亚栋、吴志明、杨靖、田哲娟、康忱、高亢、高慧敏。
I
DB 13/T 6010—2024
番茄抗病种质资源一年多代快速培育技术规程
1 范围
本文件规定了番茄抗病种质资源一年多代快速培育的前期准备、幼胚成苗、分子标记辅助选择、
种植期温光调控等技术要求。
本文件适用于番茄抗病种质资源一年多代的快速培育。
2 规范性引用文件
本文件没有规范性引用文件。
3 术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4 缩略语
下列缩略语适用于本文件：
KASP：竞争性等位基因特异性PCR（Kompetitive Allele Specific PCR）
SDS：十二烷基硫酸钠（Sodium dodecyl sulfate）
TYLCVD：黄化曲叶病毒病（Tomato yellow leaf curl virus disease）
ToMVD：番茄花叶病毒病（Tomato mosaic virus disease）
TSWVD：番茄斑萎病毒病（Tomato spotted wilt virus disease）
FCRR：镰刀菌颈腐根腐病（Fusarium crown and root rot disease）
RKN：根结线虫（Root-knot nematode）
5 前期准备
5.1 仪器、药品
超净工作台、荧光定量PCR仪、荧光定量PCR试剂盒等，其他常用实验仪器、药品见附录Ａ。
5.2 番茄种植所需设施、生产资料
5.2.1 主要设施
光照培养室、人工气候室或日光温室。
5.2.2 生产资料
育苗基质、穴盘、穴盘托等，有机肥、复合肥、磷酸二氢钾等常用肥料，百菌清、吡虫啉、菊酯
类等常用抑菌防虫药物。
6 幼胚成苗
6.1 果实采集
从番茄植株上采集授粉后25 d的果实备用。
6.2 幼胚采集
6.2.1 果实表面消毒
1
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在超净工作台内，将采集的果实浸泡在75%的酒精中10 min进行表面消毒。
6.2.2 取幼胚
用消毒后的手术刀切开果皮，从果肉中将未成熟种子自胎座上剥离。
6.2.3 清洗
用灭菌的蒸馏水洗去未成熟种子表面的果肉残渣。
6.3 幼胚培养
将清洗过的未成熟种子平铺在 1/2MS 培养基上，放置于温度 28 ℃、光照/黑暗=16h/8 h 的条件
下培养约 5 d。
6.4 移栽炼苗
将发芽种子移栽到穴盘内，加透明罩子保湿。7 d后打开罩子炼苗，幼苗生长至三叶一心期，备
用。
7 分子标记辅助选择
7.1 DNA 提取
采集番茄幼苗叶片，采用常规的SDS方法或商业试剂盒提取DNA。
7.2 分子标记检测
7.2.1 主要抗病基因的分子标记引物
针对番茄TYLCVD、ToMVD、TSWVD、FCRR和RKN等病害，应用表1给出的KASP引物，对番茄种质资源
的抗病基因进行分子标记检测。
表1 KASP 引物及基因分型判断标准
抗病基因 引物名称 引物序列（5′–3′） 等位基因 抗病类型
Ty-1 Ty-1-Allele-F1 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAATATGGTAAAGGTGCATCCAGA A : A 抗病
Ty-1-Allele-F2 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAATATGGTAAAGGTGCATCCAGT T : T 感病
Ty-1-R CCGTTGATTGAAGAAATTGATG
Mi-1 Mi-1-Allele-R1 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGATGTTTACAAGTATTTGTGGCG G : G 抗病
Mi-1-Allele-R2 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGATGTTTACAAGTATTTGTGGCA A : A 感病
Mi-1-F TTCAGACGAAGTTAGACATAAAGGA
Tm-2 2 Tm-2-Allele-F1 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAATATGCTACAAGCCAAATTACTC C : C 感病
Tm-2-Allele-F2 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAATATGCTACAAGCCAAATTACTT T : T 抗病
Tm-2-R GAAACAACTCCATAATGCAAATC
Frl Frl-Allele-F1 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTAAAGGACCATTTTTCGTAGACCATT T : T 感病
Frl-Allele-F2 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTAAAGGACCATTTTTCGTAGACCATA A : A 抗病
Frl-R ATTTCTTACCATATGTGAAGAGAA
Sw-5 FP1SNP724 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCATGGACACAACTGGAGTTATTA A : A 感病
FP2SNP724 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCATGGACACAACTGGAGTTATTG G : G 抗病
RPSNP724 CAGTCATTCTTCAAATTTTACTTGT
注： 下划线部分为FAM荧光标签序列；双下划线部分为HEX荧光标签序列。
7.2.2 KASP 检测技术
7.2.2.1 反应体系
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总体积为5 μL：PCR Mix（2×）2.5 μL，DNA溶液（40 ng～50 ng · μL
-1）0.5 μL，正向引物1（10
μmol · L
-1）0.075 μL，正向引物2（10 μmol · L
-1）0.075 μL，反向引物（10 μmol · L
-1）0.2 μL，加
ddH2O补至5 μL。
7.2.2.2 反应程序
94 ℃ 15 min；94 ℃ 20 s，65 ℃ 1 min（10个循环，每循环下降0.8 ℃）；94 ℃ 20 s，57 ℃ 1 min，
共24个循环；57 ℃ 1 min。终点法采集荧光信号。
7.2.2.3 检测结果
依据表 1 的判断标准，将基因型分为纯合抗病、纯合感病和杂合型，选择符合育种目标的番茄
幼苗。以 Ty-1 为例，基因分型结果见图 1。
图1 Ty-1 抗病基因检测结果分型
8 种植期温光调控
8.1 定植后管理
于三叶一心期进行幼苗移栽，白天温度22℃～24℃，夜间14℃～16℃；光照时间为 12 h～14 h，
配置LED植物生长灯红蓝光(1R1B)：远红光=3：1，光通量密度100±10 μmol/m
2·s。保持14 d～18 d，
至第一穗花现蕾。
8.2 现蕾后管理
白天温度24℃～26℃，夜间18℃～20℃。光照时间为 13 h～15 h，配置LED植物生长灯白光：远
红光=3：1，光通量密度120±10 μmol/m
2·s。保持8 d～10 d，至第一穗花可人工授粉。
8.3 开花后管理
人工授粉后，白天温度28℃～30℃，夜间18℃～20℃。光照时间为 14h～16 h，配置LED植物生
长灯白光或继续保持白光：远红光=3：1，光通量密度100±10 μmol/m
2·s。25天后，取果实进行下
一世代幼胚培养。
3
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附 A A A
录
（资料性）
实验室常用仪器、器具及药品
A.1 实验室常用仪器、器具及药品
高温高压灭菌锅、移液器、称量天平、冰箱(4 ℃,-20 ℃, -80 ℃)、pH测量仪、镊子、组培瓶、
酒精灯，以及MS培养基、蒸馏水、琼脂粉等。
1/2MS培养基的配置：称取4.43 g MS粉、30 g蔗糖和7.5 g琼脂粉，加水800 mL充分溶解后，定容
至2 L，调节pH至5.8，分装在500 mL锥形瓶中，高温高压灭菌20 min备用。
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