ICS 67.060
CCS
B60
DACS
团
体
标
准
T/DACS 009—2023
牛奶中四环素类药物残留的快速检测方法
酶联免疫方法
Rapid detection method of tetracycline residues in milk ELISA method
2023 - 06 - 16 发布
2023 - 06 - 16 实施
中国奶业协会 发 布
T/DACS 009—2023
前
言
本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定
起草。
本文件由内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司提出，中国奶业协会归口。
本文件起草单位：内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司、蒙牛高科乳制品（北京）有限责任公司、
北京美正生物科技有限公司、山东美正生物科技有限公司、北京市营养源研究所。
本文件主要起草人：马文丽、林立民、刘鲁林、田秀梅、倪丽丽、靳曼、严娜、杨萌、特日格乐、
刘江梅、马利军、宋晓东。
本文件首次发布。
I
T/DACS 009—2023
牛奶中四环素类药物残留的快速检测方法 酶联免疫方法
1 范围
本文件描述了牛奶中四环素、金霉素、土霉素及多西环素残留的酶联免疫测定方法。
本文件适用于牛奶中四环素、金霉素、土霉素及多西环素残留的测定。
本文件的方法检出限:四环素类药物为 2 μg/kg。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，
仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本
文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 21317 动物源性食品中四环素类兽药残留量检测方法 液相色谱-质谱/质谱法与高效液相色
谱法
GB/T 6379.3 测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第3部分：标准测量方法精密度
3 术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4 原理
将样品/试样稀释制成试样溶液，试样溶液中残留的四环素类药物与酶标板上的抗原共同竞争四环
素类药物抗体，在酶标记物的作用下，形成酶标记抗原抗体复合物与显色剂发生反应转化为有色底物，
用酶标仪测定吸光度值，根据吸光度值得出试样中四环素类药物的含量。
5 试剂与仪器设备
试剂
除另有说明外，所用试剂均为分析纯，实验室用水应符合GB/T 6682中二级水。
5.1.1 去离子水。
5.1.2 四环素类药物快速检测试剂盒。
5.1.2.1 酶标板：12 条×8 孔。
5.1.2.2 四环素类药物标准溶液。
5.1.2.3 四环素类酶标物。
5.1.2.4 四环素类抗试剂。
5.1.2.5 底物液 A/B 液。
5.1.2.6 终止液。
5.1.2.7 浓缩洗涤液。
5.1.2.8 四环素类浓缩样本稀释液。
5.1.3 样本稀释液 Ⅰ：用去离子水将四环素类浓缩样本稀释液按 1：7 体积比进行稀释。
5.1.4 样本稀释液 Ⅱ：用去离子水将四环素类浓缩样本稀释液按 1：6.27 体积比进行稀释。
仪器设备
5.2.1 微孔板酶标仪： 450nm/630nm。
5.2.2 振荡器。
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5.2.3 涡旋仪。
5.2.4 刻度移液管：10 mL。
5.2.5 洗耳球。
5.2.6 聚苯乙烯离心管：10 mL、50 mL 。
5.2.7 微量移液器：单道 10 μL~100 μL、100 μL~1000 μL ；多道移液器：30 μL ~300 μL。
6 试样的制备
生乳
取适量生乳用样本稀释液 Ⅰ 经1:9进行稀释后，作为试样溶液供酶联免疫吸附法测定。
成品奶
取适量成品奶用样本稀释液 Ⅱ 经1:9进行稀释后，作为试样溶液供酶联免疫吸附法测定。
7 分析步骤
将四环素类药物快速检测试剂盒回温至 20℃~25℃后使用，每种液体试剂使用前均须摇匀，以下
所有操作应在 20℃~25℃室温下进行。
依次加入 100 μL 系列标准溶液或试样溶液至对应的微孔底部。
吸取 50 μL 四环素类酶标物至微孔的底部。
吸取 50 μL 四环素类抗试剂至微孔的底部，轻轻振荡混匀。
将酶标板用盖板膜覆盖，置于 25℃避光环境中反应 30min。
揭开盖板膜，将孔内液体甩干，吸取洗涤液 250μL 加入微孔内，充分洗涤 4~5 次，每次间隔 10s，
充分洗涤后，将微孔板扣在吸水纸上反复拍打，以除去微孔中过多的残液，拍干后未被清除的气泡可用
未使用过的枪头戳破。
分别吸取 50 μL 底物液 A 液和底物液 B 液加入微孔板底部，轻轻振荡混匀，用盖板膜覆盖后置
25℃避光环境反应 15～20min。
吸取 50 μL 终止液加入微孔底部，轻轻振荡混匀，将酶标板置于酶标仪中，在 450 nm/630 nm 处
测量吸光度（加入终止液后应在 5min 内读取吸光度）。
8 结果计算
标准曲线至少由5个浓度组成，且其最低浓度不得高于0.2 μg/kg，按照检测试剂盒使用说明书规定
的程序操作，测定标准溶液（0.2 μg/kg, 0.6 μg/kg,1.8 μg/kg,5.4 μg/kg,16.2 μg/kg) 的吸光度值
或其他测定值。在半对数坐标纸上，以吸光度值为纵坐标，四环素类药物标准溶液浓度为横坐标绘制标
准工作曲线，从标准工作曲线上得到试样溶液上相应的四环素类药物浓度即可，可采用试剂盒生产厂家
规定的相关分析软件直接计算结果。结果表示到小数点后两位。
注： 加标回收率实验，计算结果应扣除空白本底值
检测结果=试样溶液浓度×稀释倍数
9 确证试验
如被测样品中四环素类药物残留量的值大于检出限时，应用GB/T 21317中液相色谱-质谱/质谱法
（LC-MS-MS法）进行确证。
10 精密度
本部分的精密度数据是按照GB/T 6379.3 的规定确定的，其重复性和再现性的值是以95%的可信度
来计算。
2
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附 A A A
录
（资料性）
检测方法的灵敏度、准确度、精确度
A.1 灵敏度
本方法在牛奶中的检出限为2 μg/kg。
A.2 回收率
本方法在牛奶中5 μg/kg、50 μg/kg、100 μg/kg添加浓度的回收率100%±20%。
A.3 精密度
本方法的批内变异系数应≤10%。
A.4 不同药物的交叉反应率
药物 交叉反应率
四环素 金霉素 土霉素 多西环素 100% 190% 90% 190%
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