ICS 67.120.30
B 50
T/HBIQA
河 北 省 检 验 检 疫 学 会 团 体 标 准
T/HBIQA 0003.5—2024
食品中常见高组胺鱼源性成分检测方法
第 5 部分：竹筴鱼 实时荧光 PCR 法
Detection of common Histamine-rich fish derived ingredient in food
Part5: Trachurus japonicus Real-time PCR method
2024-08-15 发布
2024-10-15 实施
河北省检验检疫学会 发 布
T/HBIQA 0003.5—2024
前
言
本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起
草。
T/HBIQA 0003-2024《食品中常见高组胺鱼源性成分检测方法 实时荧光 PCR 法系列标准》分为 7
个部分：
第 1 部分：蓝圆鰺 实时荧光 PCR 法
第 2 部分：日本鲭 实时荧光 PCR 法
第 3 部分：沙丁鱼 实时荧光 PCR 法
第 4 部分：秋刀鱼 实时荧光 PCR 法
第 5 部分：竹筴鱼 实时荧光 PCR 法
第 6 部分：鲣鱼 实时荧光 PCR 法
第 7 部分：蓝点马鲛 实时荧光 PCR 法
本文件为 T/HBIQA 0003.5-2024，第 5 部分。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由河北省检验检疫学会提出并归口。
本文件起草单位：石家庄海关技术中心、河北三狮生物科技有限公司。
本文件主要起草人：项佳林、高艺祥、付琦、刘立兵、姜彦芬、王建昌、王金凤、孙晓霞、董振国。
T/HBIQA 0003.5—2024
食品中常见高组胺鱼源性成分检测方法
第 5 部分：竹筴鱼 实时荧光 PCR 法
1 范围
本部分规定了食品中竹筴鱼源性成分的实时荧光PCR检测方法。
本部分适用于食品中竹筴鱼源性成分的定性检测。本部分所规定方法的最低检出限（LOD）为0.1%
（质量分数）。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。
3.1 竹筴鱼 Sardina pilchardus
属于鲈形目（Perciformes），鲹科（Carangidae）,竹筴鱼属。
3.2 实时荧光PCR real-time PCR
在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程。
3.3 Ct值 cycle threshold value
每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。
4 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
4.1 PCR：聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction）
4.2 DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleic acid）
4.3 NADH-6：线粒体NADH脱氢酶亚基 6 基因
4.4 dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate）
4.5 CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrithylammonium bromide）
4.6 Tris：三（羟甲基）氨基甲烷（tris（hydroxymethyl）aminomethane）
4.7 EDTA：乙二胺四乙酸（ethylene diaminetetraacetic acid）
4.8 FAM：羧基荧光素（carboxyfluorescein）
4.9 BHQ1：黑洞淬灭基团 1
5 原理
实时荧光PCR法是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现实时监测整个反应进程。
提取样品DNA为模板，以竹筴鱼NADH-6基因中相对保守且高度特异的引物和探针进行目标物的实时荧
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光PCR扩增，根据实时荧光PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的强弱判定，实现对竹筴鱼成分的
定性分析。
6 试剂和材料
6.1 实验用水应符合GB/T 6682 中一级水的规格。
6.2 检测用引物和探针序列见表 1。
表 1 引物和探针序列
名 称 序列（5′-3′） 目的基因
内参照 F: TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA 真核生物 18Sr RNA 基因
R: AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT
P: FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACC-BHQ1
竹筴鱼 F：CCCTCCATGCCCCACAA NADH-6 基因
R：TGCTGCACTTGGGTTGGTAGT
P：FAM-ACGCCACACCCCATTCCCGC-BHQ1
6.3 CTAB裂解液：20 g/L CTAB，0.1 mol/L Tris-HCI（pH 8.0），1.4 mol/L NaCl，20 mmol/L EDTA
（pH8.0）。
6.4 CTAB沉淀液：5 g/L CTAB，40 mmol/L NaCl。
6.5 蛋白酶K（20 mg/mL），-20 ℃条件下保存。
6.6 三氯甲烷，分析纯。
6.7 异丙醇，分析纯。
6.8 75%乙醇，分析纯无水乙醇配制。
6.9 荧光PCR预混液（2×）。
6.10 TE缓冲液（Tris-Cl、EDTA 缓冲液）：10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)，1 mmol/L EDTA (pH 8.0)。
7 仪器和设备
7.1 实时荧光定量PCR仪。
7.2 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。
7.3 恒温水浴锅。
7.4 离心机：最大离心力要超过 12 000 g。
7.5 微量移液器（0.1 μL～2.5 μL, 1 μL～10 μL, 10 μL～100 μL,20 μL～200 μL, 100 μL～1000 μL）。
7.6 研钵及粉碎装置。
7.7 涡旋震荡仪。
7.8 pH计：精度为 0.1。
7.9 分析天平：精度为 0.01 g。
7.10 超净工作台。
7.11 均质器。
8 检验步骤
8.1 样品前处理
鱼罐头、鱼肠、鱼丸等食品取肉糜 300 mg，置于三氯甲烷:甲醇:水混合溶液(1:2:0.8)中室温孵育过
夜，去除油脂的肌肉组织可用于核酸提取；
鱼肉、鱼排、鱼糜等鱼肉制品取 300 mg，用生理盐水清洗后，放入研钵中，在研钵中倒入液氮，
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将样品在液氮中研磨成粉末或用冷冻研磨仪研磨成粉末。
8.2 DNA提取
称取 50 mg 已制备好的样品于 2 mL 离心管中，加入 1.5 mL CTAB 裂解液和 10 μL 蛋白酶 K，
振荡混匀，65 ℃下孵育 30 min，期间每隔 10 min 振荡混匀。12 000 r/min 离心 5 min，吸取上清液至
一新离心管中，加 400 μL 三氯甲烷:异戊醇（24:1）溶液，充分混匀。12000 r/min 离心 5 min，吸取
上清液至另一新离心管中，加入 0.8 倍体积异丙醇，混匀后室温下静置 1 h。12000 r/min 离心 10
min，弃上清液；70%乙醇洗涤一次，晾干；加入 50 μL TE，溶解沉淀即为 DNA 溶液，于-20℃保存
备用。也可用等效的商业化 DNA 提取试剂盒提取样品 DNA。
8.3 DNA浓度和纯度的测定
取适量DNA溶液原液，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别测定260 nm和280 nm处的吸光
值A260和A280。DNA的浓度按照公式（1）计算：
c=A260×N×50 ··························（1）
公式（1）中：
c ——DNA浓度，单位为微克每微升（μg/μL）；
A260——260 nm处的吸光值；
N ——核酸稀释倍数。
当A260/ A280比值在1.7～2.0之间时，适宜于实时荧光PCR扩增。
8.4 实时荧光PCR检测
8.4.1 实时荧光PCR反应体系
实时荧光 PCR 反应参数见表 2。每个样品各做两个平行管，可先将反应试剂及引物预混成
混合液。
表 2 实时荧光 PCR 反应体系
试剂名称 终浓度 反应体系/μL
荧光 PCR 预混液（2×） 1× 12.5
F(10 μmol/L) 400 nmol/L 1
R(10 μmol/L) 400 nmol/L 1
P(10 μmol/L) 400 nmol/L 1
DNA模板(50-100 ng/μL) — 2.0
补水至 — 25
8.4.2 扩增条件
混匀离心后置于实时荧光PCR仪上进行扩增，扩增条件为：95℃预变性 30 s；95℃ 15 s，60℃ 35
s（收集荧光信号），40 个循环。不同仪器可根据仪器要求将实时荧光PCR反应条件作适当调整。
8.4.3 试验对照
检验过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。以竹筴鱼提取的 DNA 为阳性对照，以已
知不含有竹筴鱼的样品提取的 DNA 为阴性对照，以灭菌水为空白对照。样品、阳性对照、阴性对
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照、空白对照各设置两个平行。
9 质量控制
以下条件有一条不满足时，实验视为无效：
a) 空白对照：无荧光对数增长，相应的 Ct 值>40.0。
b) 阴性对照：无荧光对数增长，相应的 Ct 值>40.0。
c) 阳性对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的 Ct 值<30.0。
d) 内参照：被检样品有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的 Ct 值＜30.0。
10 结果判断与表述
10.1 结果判定
在符合第9章的情况下，被检样品进行检测时：
（1）如 Ct 值≤35.0，则判定为被检样品阳性，扩增靶标序列参见附录 A；
（2）如 Ct 值≥40.0，则判定为被检样品阴性；
（3）如 35.0＜Ct 值＜40.0，则重复试验。如再次扩增后 Ct 值仍为＜40.0，且出现典型扩增曲线，
则判定被检样品阳性；如再次扩增后 Ct 值≥40.0，则判定为被检样品阴性。
10.2 结果表述
10.2.1 结果为阳性，表述为“检出竹筴鱼源性成分”。
10.2.2 结果为阴性，表述为“未检出竹筴鱼源性成分”。
11 防污染措施
检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T 27403的规定执行。
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附录 A
（资料性）
A.1 竹筴鱼NADH-6 基因扩增参考序列（Genbank序列号NC_024556.1）
5'-CCCTCCATGCCCCACAAGAACGCCACACCCCATTCCCGCTACCACTACCAACCC
AAGTGCAGCA-3'
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